B cell stimulatory factor-2, B-cell differentiation factor, BSF2, BSF-2, BSF2CTL differentiation factor, CDF, HGFHSFIFNB2Hybridoma growth factor, IFNB2, IFN-beta-2, IL6, IL-6, IL-6B-cell stimulatory factor 2, Interferon beta-2, interleukin 6 (interferon, beta 2), interleukin BSF-2, interleukin-6, MGI-2A,小鼠白介素6ELisa试剂盒

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗小鼠IL-6抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生物素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的IL-6与固相抗体和检测抗体结合，形成免疫复合物。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）。洗涤后，加入显色底物，避光显色。加入终止液终止反应，在450nm波长（参考校正波长540nm或570nm）测定吸光度值。

请在试剂盒有效期内使用（新老产品随机发货）

组成	规格	拆封后，稀释或重溶的试剂有效期
Mouse IL-6 Microplate	1块	将未使用的板条放回带有干燥剂的铝箔袋中密封后，可在2-8℃储存30天
Mouse IL-6标准品	2支	溶解后，计算用量分装，可在-20°C储存14天
Mouse IL-6检测抗体	1支	浓缩体积溶解后，可在2-8°C储存14天
40×SA-HRP	1支	40×浓度可在2-8°C储存；1×工作浓度不建议保存
10×浓缩稀释用缓冲液	1瓶	开封后，可在2-8°C储存30天
显色液	1瓶
终止液	1瓶
20×浓缩洗涤缓冲液	1瓶
封板膜	3张	常温储存，为避免污染，不可重复使用

15.6pg/mL-1000pg/mL

需自备试验器材
1. 酶标仪（可测量450nm检测波长的吸收值及540nm或570nm校正波长的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸头
3. 蒸馏水或去离子水
4. 洗瓶（喷瓶）、多通道洗板器或自动洗板机
5. 500mL量筒

一、实验前准备
1. 样品搜集及储存
①细胞培养上清：颗粒物应通过离心去除；立刻检测样本。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
②血清：使用血清分离管（SST）收集样本，样品室温放置30分钟。离心15分钟，转速为1000g。立即取出血清，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
③血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸作为抗凝血剂收集血浆，在收集后30分钟内离心15分钟，转速为1000g，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
2. 试剂配制（使用前请将所有试剂和样本放置于室温，静置 15 分钟。建议所有的实验样本和标准品做复孔检测）
①1×洗涤液配制：试剂盒中的浓缩洗涤液为20×母液，使用前需使用蒸馏水稀释为1×工作液。例：取10mL浓缩洗涤液+190mL蒸馏水定容至200mL，实际操作时可先计算使用量，再进行配制。
②1×稀释用缓冲液配制：试剂盒中的浓缩稀释用缓冲液为10×母液，使用前需使用蒸馏水稀释至1×工作液。例：取3mL浓缩稀释用缓冲液+27mL蒸馏水定容至30mL。实际操作时可先依据样本稀释倍数，计算所需的稀释用缓冲液用量，再进行配制。
③检测抗体：将干粉离心至管底，使用110uL稀释用缓冲液（1×）溶解，室温静置5分钟后得到100×母液；使用前需稀释为1×工作液。按照每孔用量100uL计算所需体积。例：使用了10个孔，则取10uL的100倍工作浓度的检测抗体，使用稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
④SA-HRP：SA-HRP为40×母液，使用前需使用稀释缓冲液（1×）稀释配制成1×工作液，每孔所需量为100uL。例：使用了10个孔，则取25uL的40×母液+975uL稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
⑤显色剂：按每孔100uL，计算当次试验所需要用量，取出相应体积的显色剂，避光；取出的显色剂仅供当日使用。
⑥标准品：冻干标准品用稀释用缓冲液（1×）重溶，重溶体积1000uL，得到浓度为1000pg/mL标准品母液。轻轻震摇至少5分钟，其充分溶解。每个稀释管中加入300uL稀释用缓冲液（1×）。将标准品母液参照下图做系列稀释，每管须充分混匀后再移液到下一管。没有稀释的标准品母液可用作标准曲线最高点（1000pg/mL），稀释用缓冲液（1×）可用作标准曲线零点（0pg/mL）。

二、操作步骤
1. 准备好所有需要的试剂和标准品；
2. 从已平衡至室温的密封袋中取出微孔板，未用的板条请放回铝箔袋内，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗涤液，静置浸泡30秒，弃掉洗液在吸水纸上将微孔板拍干，请立即使用不要让微孔板干燥；
4. 分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔100uL。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时;
5. 将板内液体吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自动洗板机洗板。每孔加洗涤液300uL，然后将板内洗涤液吸去。重复操作3次。每次洗板尽量吸去残留液体会有助于得到好的实验结果。最后一次洗板结束，请将板内所有液体吸干或将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；
6. 在每个微孔内加入100uL检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时；
7. 重复第5步洗板操作；
8. 在每个微孔内加入100uLSA-HRP，室温孵育20分钟。注意避光；
9. 重复第5步洗板操作；
10. 在每个微孔内加入100uL显色液，室温孵育5-30分钟，注意避光；
11. 在每个微孔内加入50uL终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。如果溶液颜色变为绿色或者颜色变化不一致，请轻拍微孔板，使溶液混合均匀；
12. 加入终止液后30分钟内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定540nm或570nm作为校正波长。如果没有使用双波长校正，结果准确度可能会受影响；
13. 计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD值。使用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线。另一种方法是，可以通过绘制标准品浓度做对数与相应OD值对数生成曲线，并通过回归分析确定最佳拟合线。这个过程可生成一个足够使用但不太精确的数据拟合。若样本经过稀释，计算浓度时应乘以稀释倍数。

注：提供的标准曲线数据仅供参考，应根据同次试验所绘标准曲线计算样本含量。

三、试剂盒参数
1. 回收率：在细胞培养基样本中掺入不同水平的Mouse IL-6，测定其回收率。回收率范围在70-114%，平均回收率在91%。
2. 灵敏度：Mouse IL-6的最低可测剂量（MDD）一般小于1.8pg/mL。最低可测值是根据20个标准曲线零点吸光值的平均值加两倍标准差计算得到的相对应浓度。
3. 校正：此ELISA试剂盒经大肠杆菌表达的高纯度重组Mouse IL-6蛋白所校正。
4. 线性：4个不同的样本中掺入高浓度的Mouse IL-6，然后用稀释剂（1×）将样本稀释到检测范围内，测定其线性。

稀释倍数	平均值/期待值（%）	范围（%）
1：2	100	98-109
1：4	102	95-108
1：8	109	102-112
1：16	117	112-120

5. 特异性：此ELISA法可检测天然及重组Mouse IL-6蛋白。将以下因子用稀释剂（1×）配制成 50ng/mL的浓度来检测与Mouse IL-6的交叉反应。将50ng/mL的干扰因子掺入中间范围的重组Mouse IL-6对照品中，来检测对Mouse IL-6的干扰。没有观察到明显的交叉反应或干扰。

重组人蛋白	重组小鼠蛋白
IL-6	IL-6

四、常见问题解析
1. 白板（显色完成后，无颜色出现）

序号	可能原因	解决方案
1	试剂盒储存不当；不同试剂盒试剂混用	购买新试剂盒，注意储存条件；不可混用
2	赋予温度低，时间短	如果温度偏低，则延长孵育时间和显色时间
3	错加、漏加试剂	严格按照说明书步骤添加正确试剂
4	用于配置溶液的容器不干净，或水有问题	使用干净容器以及合格的蒸馏水
5	洗板过程中浸泡时间长，洗板次数太多，洗板冲击力大	严格按照说明书操作
6	试剂温度不均一	所有试剂要室温平衡30分钟
7	检测抗体和/或HRP浓度太低	参照说明书，不可随意稀释

2. 花板（空白、阴性阳性对照正常，但标本孔OD值明显偏高）

序号	可能原因	解决方案
1	洗涤次数少，不充分	按照说明书要求洗涤
2	底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）被金属离子或氧化剂污染或曝光	配制时使用干净容器以及合格的蒸馏水；避光保存
3	孵育温度高和/或时间过长	控制孵育和最后酶促反应的温度和时间
4	加样时未更换枪头，造成交叉污染	每个样都更换枪头
5	附近孔交叉污染	垂直拍板，使用合适的拍板纸，避免孔内进入纸屑
6	样本存在内源性干扰物质	推测可能的感染物质，并进行对应处理
7	样本溶血、贮存过久、凝集不全、被细菌污染、采血管中添加物影响	避免溶血、污染、过久储存等现象

五、实验流程图

白细胞介素-6（IL-6）是一个具有α螺旋结构，22-28kD的磷酸化和不同程度糖基化的多功能细胞因子，它在疾病急性期反应、炎症、造血、骨代谢以及癌症恶化等方面起重要作用。成熟的小鼠IL-6有187个氨基酸，与人和大鼠IL-6分别有42%和85%同源性。IL-6内部的选择性剪接而产生多种异构体，有些剪接体表现出拮抗特性。已知表达IL-6的细胞，包括CD8+T细胞、成纤维细胞、滑膜细胞、脂肪细胞、成骨细胞、巨核细胞、内皮细胞（在内皮素的影响下）、交感神经元、大脑皮质神经细胞、肾上腺髓质嗜铬细胞、视网膜色素细胞、肥大细胞、角质形成细胞、朗格汉斯细胞、胎儿及成人星形胶质细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞，结肠上皮细胞、B1B细胞和胰岛β细胞。IL-6的产生通常是在糖皮质激素、儿茶酚胺和第二性类固醇的控制下，一般与细胞激活相关。正常人血液中的IL-6在1pg/mL范围内，在月经期略有升高、在某些癌症的中晚期中度增高、在大型手术后有显著升高。
IL-6通过细胞表面受体引发细胞信号，该受体是由配体结合亚单位（IL-6受体）和信号转导亚单位gp130组成的异二聚体复合物。IL-6结合到IL-6受体上，引发了IL-6受体与gp130的结合及gp130的二聚体化。gp130也是CLC、CNTF、CT-1、IL-11、IL-27、LIF和OSM受体的组成部分。可溶性IL-6受体是由选择性剪接和蛋白酶切割产生的。通过反式信号转导机制，可溶性IL-6和IL-6受体复合可引发表面缺乏IL-6受体，但表达gp130细胞的应答。IL-6受体的表达主要局限于肝细胞、单核细胞、淋巴细胞和静息淋巴细胞，由于gp130分子表达非常广泛，反式信号转导实现了更广泛的细胞类型对IL-6的响应。可溶性gp130剪接体阻止了IL-6/IL-6R的反式信号转导，但不能阻止其它细胞因子利用gp130分子作为共同受体的信号转导。
IL-6与肿瘤坏死因子α（TNF-α）和IL-1一道，所引起的急性炎症反应，在发热和肝脏急性炎症反应中几乎起着独一无二的作用，它在从急性炎症到获得性免疫或者慢性炎性疾病的转化中也发挥重要作用。IL-6失调可促进慢性炎症，如肥胖、胰岛素抵抗、炎症性肠道疾病、炎性关节炎以及败血症，往往涉及IL-6的反式信号转导。在转化生长因子TGF-β存在的情况下，IL-6在幼稚型T细胞相Th17炎性细胞分化的过程中起重要作用。IL-6调节骨吸收，通过促进Th17炎性细胞的活性，是类风湿性关节炎中造成炎性关节损伤的主要因素。IL-6参与动脉粥样硬化斑块的形成和非稳定性。然而，IL-6也有抗炎症作用，如体育锻炼时骨骼肌分泌IL-6，它作为造血干细胞的生长因子促进造血、诱导B细胞成熟为浆细胞、多发性骨髓瘤细胞的永生。IL-6也促进，但可能不会启动其它炎症相关的癌症发生，如结肠炎相关癌症。

未开封试剂盒，2-8°C储存。

1. 请在试剂盒有效期内使用。
2. 不同试剂盒及不同批号试剂盒的组分不能混用。
3. 样本值若大于标准曲线的最高值，应将样本用稀释剂（1×）稀释后重新检测；若细胞培养上清液样本需分布稀释，除最后一步用稀释剂稀释外，其它中间稀释可采用细胞培养基。
4. 检测结果的不同可由多种因素引起，包括实验人员的操作、移液器的使用方式、洗板技术、反应时间或温度、试剂盒的储存等。
5. 试剂盒中的终止液是酸性溶液，使用时请做好眼镜、手、面部及衣服的防护。