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产品资料 – 用于二代测序的 NEBNext® 试剂 – 适用于所有测序平台/模块和酶
NEBNext® 高输入量 Poly(A) mRNA 分离模块 收藏
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#E3370S
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产品特点：
• 高输入量：5 – 50 µg 总 RNA（不含 DNA）
• 较小体积的洗脱液
• 更快速的实验流程
• 自动化兼容
概述：
NEBNext® 高输入量 Poly(A) mRNA 分离模块可以从高输入量（每 0.2 ml 反应含 5 – 50 µg）的已分离的总 RNA 中提取完整的 poly(A)+ RNA。该技术的原理是将 Oligod(T)25 与顺磁性磁珠偶联后，以此为固相支持物直接结合 poly(A)+ RNA。利用此方法可以进行多个样本的手动处理，也适用于自动化高通量应用。此外，磁性分离技术可得到较小体积的完整 RNA 洗脱液，不需要再从洗脱液中沉淀 poly(A)+ RNA。因此在 1 小时内就能分离得到体现原始样品中 mRNA 种群特性的完整 poly(A)+ RNA。
起始量低于 5 µg 时，推荐使用 NEBNext® Poly(A) mRNA 磁性分离模块（NEB #E7490）
产品描述：
针对不同起始量样本，NEBNext® 高输入量 Poly(A) mRNA 分离模块均可提供一致的表达水平
A.使用 NEBNext® 高输入量 Poly(A) mRNA 分离模块从 50 μg 或 5 μg 含有 ERCC RNA 和 Spike-In RNA Variants (SIRV Set 4, Lexogen®)的总通用人类参考（UHR）RNA（Agilent®）中富集 Poly(A) RNA。使用 Qubit® RNA High Sensitivity Assay Kit（Invitrogen®）评估总产量。Poly(A) RNA 通常约占总 RNA 的 1 – 5%。
B.使用 Agilent 的 Bioanalyzer® 分别追踪以下三种 RNA：总 UHR RNA、从 50 μg 起始总 RNA 中富集到的 poly(A) RNA 和从 5 μg 起始总 RNA 中富集到的 poly(A) RNA。
C.以 40 ng（50 μg 起始量）或 8 ng（5 μg 起始量）经 poly(A) 富集后的 RNA 为样本，使用 NEBNext® Ultra™ II RNA 链特异性文库制备试剂盒制备文库后在 Illumina® NextSeq® 550 平台进行测序并测定转录本丰度。每个文库抽取 600 万 Reads。
针对不同的起始样本类型，使用 NEBNext® 高输入量 Poly(A) mRNA 分离模块后残留的核糖体 RNA 均很低
使用 Dynabeads® mRNA Purification Kit（Invitrogen）、Poly（A） Purist™ MAG (Invitrogen) 和 NEBNext® 高输入量 Poly(A) mRNA 分离模块分别从 50 μg 人类通用参考 RNA（UHR, Agilent）、小鼠肾脏组织总 RNA 和酿酒酵母（酵母）总 RNA 中富集 Poly(A) RNA。小鼠肾脏组织总 RNA 和酿酒酵母（酵母）总 RNA 提取采用 Monarch® Total RNA Miniprep Kit。
A.总 RNA 和 poly(A) 富集 RNA 的代表性 Bioanalyzer 结果。
B.通过三次重复（UHR 和 小鼠 poly(A) 样本）和两次重复（总 RNA 和酵母 poly(A) RNA 样本）测序实验确定总 RNA 和 poly(A) 富集 RNA 样本中核糖体 RNA（rRNA）所占百分比，并计算标准偏差。以 40 ng poly(A) 富集 RNA 为样本，使用 NEBNext® Ultra™ II RNA 链特异性文库制备试剂盒制备文库后在 Illumina® NextSeq® 550 平台进行测序。每个文库抽取 600 万 Reads。
使用 NEBNext® 高输入量 Poly(A) mRNA 分离模块提取的 RNA，可以为 nanopore 测序制备更高产量、更高 mapping 率的文库
以使用推荐方法从人类通用参考 RNA（UHR）中富集的 400 ng Poly(A) RNA 作为起始样本，在 GridION® 测序仪（Oxford Nanopore Technologies®）上进行 Direct RNA 测序（ONT #SQK-RNA002）。以使用推荐方法从人类通用参考 RNA（UHR）中富集的 100 ng Poly(A) RNA 作为起始样本，在 GridION® 测序仪上进行 Direct cDNA 测序（ONT #SQK-DCS109）。
A.使用 Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Invitrogen) 评估文库产量；图示为带有标准偏差的重复结果的平均值。
B.图示为 Direct RNA 和 Direct cDNA 测序重复样本的平均 mapping 率，带有标准偏差。
使用 NEBNext® 高输入量 Poly(A) mRNA 分离模块，可以为 direct RNA 和 cDNA 测序提供高质量的起始 poly(A) mRNA
以使用 NEBNext® 高输入量 Poly(A) mRNA 分离模块从 UHR RNA 中富集的 poly(A) RNA 为起始样本制备文库，随后在 Nanopore Technologies 平台进行 Direct RNA (A) 和 Direct cDNA (B) 测序，图中所示为前 1000 个转录本 5´➝3´ 的转录本覆盖度。