FAOBlue—脂肪酸β-氧化（FAO）活性荧光定量试剂

Funakoshi品牌的FAOBlue是一款可通过荧光成像将活细胞内脂肪酸β-氧化（FAO）活性可视化的试剂。只需将产品添加到培养基中，即可通过荧光观察定量脂肪酸β-氧化活性。

FAO（脂肪酸β-氧化，Fatty acid beta-oxidation）

脂肪酸（FA）是多种脂质的基本成分，是细胞的重要组成部分，同时也是能量的主要来源之一。FA降解的主要途径是通过线粒体脂肪酸β-氧化（FAO）。FAO 是肝脏、心脏和骨骼肌等器官能量平衡的关键代谢途径。

FAO是一个复杂的生化过程，涉及多种酶的参与。FAO主要分为以下四个步骤：

1) 脱氢：脂酰-CoA 被酰基CoA脱氢酶氧化成烯酰基-CoA；

2) 水合：烯酰-CoA-被烯酰-CoA水合酶合成-3-羟基乙酰-CoA；

3) 氧化：3-羟基乙酰-CoA转化为 3-酮酰-CoA；

4) 硫解：3-酮酰-CoA转化为酰基-CoA（Cn-2）和乙酰-CoA。乙酰-CoA进一步转化为ATP。生成的酰基-CoA（Cn-2）进入另一个FAO循环，进一步生成酰基-CoA（Cn-4）。

研究表明，FAO代谢异常与肥胖和非酒精性脂肪肝病（NAFLD）等多种疾病密切相关，因此检测FAO活性对于诊断相关疾病至关重要。但由于FAO过程较为复杂，使得在活细胞中检测FAO活性的方法非常有限。目前只有一些间接方法，如使用含放射性同位素的脂肪酸或测量耗氧量。

FAOBlue作为首款直接测量活细胞中FAO活性的试剂，只需在培养基中加入FAOBlue，即可通过荧光成像，简单地检测出活细胞中FAO的活性。

FAOBlue原理

FAOBlue是一种具有被乙酰氧甲基酯保护的壬酸（C9）的香豆素染料。在被FAO代谢之前，FAOBlue在405 nm下不会激发荧光。FAOBlue的乙酰氧基甲酯可被细胞内的酯酶水解，使FAOBlue可直接穿透细胞膜进入细胞，转化为游离脂肪酸（Free FA type）；Free FA type会转化为Acyl-CoA，并进入FAO循环；Acyl-CoA 经过3次FAO循环分解为含有丙酸（C3）的非荧光香豆素。经过第4次FAO循环后，香豆素染料从丙酸中释放出来并扩散到整个细胞。此时整个细胞内的香豆素在405 nm下发出强烈的蓝色荧光，可视化地定量检测细胞中FAO的活性。

产品信息

产品特点

操作简单，加入培养基后，孵育30-120min即可观察荧光；

实例验证适用于多种细胞类型。

产品应用

FAO活性的相对定量

评估药物对FAO活性的影响

实验步骤

1、在新鲜的HEPES缓冲液（HBS）中加入FAOBlue（最终浓度为5-20μM）；

注：可用无血清培养基代替HBS

2、去除培养基，用HBS清洗细胞2次；

3、向细胞中加入含FAOBlue的HBS；

4、在37℃下培养30 min以上；

注：不同细胞类型最佳培养时间有所不同，建议根据具体情况而定。

5、用HBS清洗细胞；

6、通过成像观察活细胞中的蓝色荧光（Ex. 405 nm/Em. 430～480 nm）。

成像指南

激光共聚焦显微镜：使用显微镜中配备的405 nm激光

落射荧光显微镜：激发滤光片非常重要，建议使用波长为 390-450 nm的激发滤光片

应用实例

一、FAOBlue及其香豆素衍生物的吸收光谱和荧光光谱

在PBS缓冲液（pH 7.4）中，FAO代谢后释放的FAOBlue和香豆素衍生物的吸收光谱（左）、荧光光谱（右）。

FAOBlue经过FAO转化为香豆素衍生物后，吸收峰从FAOBlue发生偏移至405 nm。因此，在405 nm的激发条件下，FAOBlue不会发出荧光，只有在通过FAO释放香豆素衍生物时才会发出蓝色荧光。

注：FAOBlue在300-380 nm（最大350 nm）激发时显示蓝色荧光（灰色线，370-450 nm），所以在选择滤光片时请格外注意，避免同时激发未反应的FAOBlue以及FAO反应后的香豆素衍生物。

二、各种癌细胞中FAO活性可视化

在4种癌细胞中加入FAOBlue，培养一定时间后进行荧光观察。所有细胞都出现蓝色荧光，而经过FAO抑制剂etomoxir处理后蓝色荧光显著减少。这些数据表明，蓝色荧光是由活细胞中FAO活性引起的。（注：实验条件根据细胞类型不同而不同）

※HepG2 : 5 μM, 30 min、 LNCaP: 20 μM, 120 min、HeLa : 20 μM, 120 min、A549 : 5 μM, 30 min

三、药物对FAO活性的干扰

对HepG2细胞分别进行AICAR（通过 AMPK 激活的 FAO 激活剂）和ranolazine（部分 FAO 抑制剂）处理，随后加入FAOBlue（5uM）孵育30分钟。结果显示，与对照细胞（未处理）相比，AICAR处理后明显增加蓝色荧光强度，ranolazine处理后则明显降低蓝色荧光强度。

四、药物对FAO活性影响的定量分析

将HepG2细胞与不同浓度的ND630预孵育4小时。ND630处理后，加入FAOBlue（5uM）孵育30分钟。结果表明，伴随ND630浓度增加，蓝色荧光强度随之增加。由此可知，ND630可增强FAO活性。（注：ND630是乙酰-CoA羧化酶抑制剂，被认为是治疗非酒精性脂肪肝（NAFLD）的潜在药物）

五、NASH模型小鼠的FAO活性分析

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是一种与脂质相关的疾病，表现为脂肪酸代谢活性低。向正常小鼠和NASH模型小鼠以口服形式给药增强脂质代谢的bezafibrate后，提取原代肝细胞。向各组细胞加入FAOBlue（5 μM）观察其FAO活性，结果显示，相较正常小鼠来源细胞，NASH模型小鼠来源细胞的FAO活性明显被抑制。另外，给药bezafibrate的NASH模型小鼠来源细胞中FAO活性被恢复。

产品文献

Uchinomiya et al., Chem. Commun., 56, 3023-3026 (2020) Fluorescence Detection of Metabolic Activity of Fatty Acid Beta Oxidation Activity in Living Cells.

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