随着基因细胞治疗的快速发展，多种病毒载体被用于基因细胞治疗，这些载体大都使用293系列细胞（如：HEK293, 293T等）进行生产，这就导致293系列细胞残留DNA会作为杂质存在于载体终产品中。由于宿主细胞DNA的稳定性，容易在生产过程中产生残留，而这些生物制品应用到人类疾病治疗时，会带来不可控危险因素。因此宿主核酸残留一项是各类质控标准必检项， 必须遵循WHO、FDA以及我国NMPA监管条例，确保宿主核酸残留在安全可控范围内。
        293T细胞残留DNA检测试剂盒专一性强，能快速、特异地检测生物制品和基因细胞治疗产品中293T细胞的DNA残留。
        建议所有使用该试剂盒的实验室按需可做以下验证：标准品线性、 样本线性、 准确度（加标回收率）、定量限、精密度(重复性)、 分析特异性以及阴性参考品符合率。 
        样本线性：依据 YY/T 1182-2020 的相关要求，在线性范围内，取接近线性范围上限的高值样本按一定比例（如 5 倍或 10 倍）稀释为至少 5 种浓度，其中低值浓度样本须接近线性范围的下限，将每一浓度样本检测 1 次或多次，计算每一浓度的对数均值和稀释比例(或理论浓度)的对数值，以浓度的对数均值为 Y，稀释比例(或理论浓度)的对数值为 X 进行线性拟合，计算其线性相关系数 r。 
        分析特异性验证：验证需避免工艺杂质对检测结果的干扰，必要时可对样本进行核酸提取纯化。为避免基质干扰和保证检测有效性建议使用纯度较高的 DNA 进行相应稀释后来做验证。 
        精密度/定量限：验证时，如需同时配制标曲，需控制 CV，避免重复操作过多，CV 偏大影响标曲建立和精密度/定量限验证。 
        数据分析：由于仪器不同，数据阈值线会存在区别，故在数据分析时需依据实际情况统一阈值线再进行数据分析比较。 
        样本核酸提取纯化：可与“宿主细胞残留 DNA（磁珠法）样本前处理试剂盒”配合使用。该试剂盒主要用于生物制品样本中微量核酸的提取，可精准抽提各种生物制品中宿主细胞残留 DNA，适 用于多种基质缓冲溶液，可有效提取纯化微量的 DNA。
产品特点：
精密度高：低浓度重复性CV值<20%；中高浓度重复性CV值<15%
线性标准：依据国标的基本要求，各项指标全，标准高，结果稳定可靠
快速高效：检测快速，一小时即可出结果
产品性能指标：
线性范围：300pg/µL~0.03pg/µL； 
标准品线性：R2≥0.980，扩增效率 90%≤Eff（%）≤110%，各浓度检测值 CV<15%。 
准确度（加标回收率）：70%-130%。 
定量限：0.03pg/µL，CV≤20%，测量偏差不大于|±20%|。 
精密度(重复性)：高、中两个浓度参考品各 10次，变异系数CV<15%。 
分析特异性：考察生物制品生产中常用的 DNA 对检测试剂盒的干扰，检测均值小于定量限或未检出，判定无干扰。 
阴性参考品符合率：比标准曲线中最低点高 2~3 个 Ct 值左右。
适用机型（包括但不限于）：LightCycler 480，ABI QuantStudio 3，Bio-Rad CFX Opus96 等。 
冻融稳定性：5 次以上。

依据《美国药典》<509>通则和<1130>以及《中国药典》通则<3407> 中的各种检测方法，最终选择更准确、可靠、科学的荧光探针（TaqMan ®）qPCR 法作为细胞残留 DNA 检测的方法。TaqMan ®荧光探针是一种寡核苷酸探针，其 5’末端携带荧光基团（报告基团），如 FAM、TET、VIC等，3’端携带淬灭基团，如 TAMRA、BHQ1 等。PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一条特异性的荧光探针，探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR 扩增时，Taq 酶的 5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统（荧光定量 PCR 仪）可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。该方法具有特异性强、灵敏度高等特点，在目前生物制药细胞核酸残留检测中被广泛使用。

编号	组成	规格	储存条件
1	293T Primer&Probe MIX	550µL	-20℃避光保存
2	2×qPCR Reaction MIX	1.6mL	-20℃
3	293T DNA 定量参考品（30ng/µL）	50µL	-20℃
4	DNA稀释液	1.5mL×3	-20℃

本试剂盒配套有 293T DNA 定量参考品可快速准确定量检测各种生物制品（基因细胞治疗的腺相关病毒/慢病毒相关制品、逆转录病毒和蛋白制品等）的中间品、半成品和原液以及成品中 293T 残留 DNA。试剂盒的线性范围为：0.03pg/µL~300pg/µL。

一、准备工作：
1、试剂盒准备： 
将试剂盒各组分置于冰上或 4℃，确保充分溶解后开始操作。
2、需自备的耗材及设备： 
（1）荧光定量 PCR 仪、涡旋仪、离心机 
（2）高精度移液器及一次性无菌无酶低吸附带滤芯吸头（0.5-10µL、10-100µL、20-200µL、100-1000µL） 
（3）1.5mL 无菌无酶低吸附离心管 
（4）无菌无酶八联管或 96 孔 qPCR 板
二、操作流程：
1、操作详细步骤： 
（1）qPCR 反应液的制备： 
   ①根据所需检测的参考品和待测样品数量（一般做 3 组复孔）， 分别计算反应所需孔数： 
   反应孔数=（参考品 ST1-5+1 个无模板对照 NTC+待测样品）×3 
   ②根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量： 
   qPCR MIX =（反应孔数+2 或 3）×15μL（2×qPCR Reaction MIX）+ （反应孔数+2 或 3）×5μL（293T Primer&Probe MIX）（2 或 3 为操作损失量） 
   ③将所用试剂置于冰上完全溶解，轻微振荡混匀，瞬时离心，按下表所示配制：
表 2 qPCR MIX 配制表

组分	单个反应量
2×qPCR Reaction MIX	15μL
293T Primer&Probe MIX	5μL
总体积	20μL

    ④将配制的 qPCR MIX，轻微振荡混匀，瞬时离心，按 20μL/孔分装至八联管或者 96 孔板中。 
    ⑤将DNA稀释液按10μL/孔加到分装了 qPCR MIX 八联管或者 96 孔板中，具体加样见表 4。 
（2）定量参考品的稀释： 
（注：根据试剂盒提供的标准品按照需求配制） 
用试剂盒提供的 DNA 稀释液将 DNA 定量参考品（30ng/μL）系列倍比（稀释倍数：10 倍）稀释，稀释浓度依次为 3000 pg/μL，300 pg/μL，30 pg/μL，3 pg/μL，0.3 pg/μL，0.03 pg/μL。 
具体步骤如下： 
①将试剂盒中的 DNA 定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上或 2-8℃条件下融化。待完全溶解后，轻微振荡混匀，离心 3~5 s。 
②取干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。 
③在 ST0 管中用 DNA 稀释液将 DNA 定量参考品（30ng/μL）稀释至 3000 pg/μL，轻微振荡混匀，离心 3~5 s。确保 DNA 定量参考品与DNA 稀释液充分混匀，使用时避免反复冻融。 
④在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分别加入 90μL DNA 稀释液，再进行梯度稀释，稀释方法如下所示：
                            表 3 DNA 定量参考品的稀释

稀释管	稀释体积	终浓度（pg/μL）
ST1	10 μL ST0+90 μL DNA 稀释液	300
ST2	10 μL ST1+90 μL DNA 稀释液	30
ST3	10 μL ST2+90 μL DNA 稀释液	3
ST4	10 μL ST3+90 μL DNA 稀释液	0.3
ST5	10 μL ST4+90 μL DNA 稀释液	0.03

【注】：标准曲线浓度点可根据实际验证结果进行选择，应至少包含 5 个浓度点。
已融化未使用的 DNA 稀释液可在 2-8℃短暂保存，若长期不使用，请储存于-20℃。 稀释方法可根据实验需要进行调整。
（3）qPCR 加样：
   ①将所需试剂置于冰上操作，轻微振荡混匀，瞬时离心，加样（总体积 30μL）：

                                表 4 MIX 各反应孔加样示例

参考品	参考品 ST1-5 各 10μL+所需 qPCR MIX 量 20μL
无模板对照NTC	DNA 稀释液各 10μL+所需 qPCR MIX 量 20μL
待测样品	待测样品各 10μL+所需 qPCR MIX 量 20μL

     ②实验可使用无菌无酶的八联管或者 96 孔板进行反应，需去除反应体系中的气泡，并离心至管底准备反应。
（4）qPCR 反应程序参数设置：
以美国 ABI 7500 Real-Time PCR System、软件版本 2.06 为例。
       1)在Experiment Propertie s 页面创建空白新程序如图所示 ：

①Experiment name：修改实验名称。
②Experiment type： 选择程序（Quantitation-Standard Curve）。
③Reagents：选择实验方法（TaqMan ® Reagents ）。
    2)创建该产品检测探针，选择①界面，点击②创建探针，在TargetName中编辑探针名称并命名，在Reporter③和Quencher④中选择所需的荧光基团和淬灭基团。本产品荧光基团选择FAM，淬灭基团为None，参比荧光为ROX。点击⑤创建样品，在相应的Samplename⑥一栏中命名样品的名称。

    3) 在 Plate Setup ①界面，将标准曲线孔在 Task② 一栏设置为“S”③，并且在 Quantity④一栏分别赋值设为 300，30，3，0.3，0.03（单位为 pg/μL），并且在相应的 Sample name 一栏中命名为ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。在 Plate Setup ①界面中，将无模板对照 NTC 孔在 Task②一栏设置为“N”⑤，将待测样本孔在Task②一栏设置为“U”⑥，并且在相应的 Sample name 一栏中命名样品的名称。（图例仅供参考）

     4) 设 置 反 应 程 序 ：

Stsge1	污染消化	Reps：1	50℃	2min	程序中 62℃ 30s 处设置为荧光收集①； 反应体积 30μL。
Stage2	预变性	Reps：1	95℃	10min
Stage3	循环反应	Reps：40	95℃	3s
			62℃	30s

      5) 点 击 Run 界 面 的 “Start Run”按 钮 进 行 PCR 测 定 。

三、结果分析：
以美国 ABI 7500 Real-Time PCR System、软件版本 2.06 为例。
1、在 Analysis 的 Amplification Plot①面板中，点击 Reanalyse②，初步查看扩增曲线的形态是否正常。在 Analysis 的 Standard Curve③面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、R 2和扩增效率（Eff%）④等。在 Analysis 的 View Well Table⑤面板中，Quantity Mean 一栏可读取待测样本的检测值，单位为 pg/μL。（图例仅供参考）

2、结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。

试剂盒应在-20℃条件下保存，有效期为 12 个月。开封后未使用完的试剂盒注意仍在规定储存条件下保存。

1、本试剂盒已通过稳定性（冻融等因素）的验证，无需分装。
2、阴性样品（2×qPCR Reaction MIX、Primer&Probe MIX 和 DNA稀释液等）和阳性样品（参考品和待测样品等）的配制和加样环境需区分区域，不可在一个区域内操作，配制人员需穿戴整齐，戴好口罩、手套和穿好洁净服。
3、注意在不同加样步骤间及时更换吸头，避免交叉污染，避免长时开盖，使用移液器移液时，需避免液体挂壁。
4、试剂盒必须在有效期内使用，每次实验均需重新制备相应的标准曲线，不建议不同标准曲线之间混用，不建议不同批次的相关试剂混用。
5、试剂盒内所有组分建议在低温环境融化后使用，且需确保其充分溶解，各组分使用前需充分混匀，以保证试剂的均一性，经混匀的试剂需经短暂离心，以使管壁及盖子上的液体全部集中于管底。若发现DNA 稀释液中有析出物，建议于 37 ℃条件下进行孵育，使 DNA 稀释液完全溶解。
6、只有严格遵守说明书的操作方法，全部使用本试剂盒配套的试剂才能保证最佳检测效果。
7、最终的试验结果与试剂的有效性、操作者的操作方法及试验环境密切相关。
8、公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。