触发天然免疫和自噬的线粒体DNA

线粒体是独特的哺乳动物细胞器，以细胞的能量工厂著称，普遍认为是由需氧菌进化而成。线粒体在细胞代谢和细胞凋亡中扮演重要角色。越来越多的研究表明，线粒体在天然免疫中有核心作用，并可能促成炎症疾病。在感染和应激之后，受损的线粒体释放其组分，包括线粒体 DNA（mtDNA），后者是一种强效的损伤相关分子模式（DAMP），可通过多种模式识别受体（PRRs）诱导炎症反应。参与识别mtDNA的主要几种PRRs是：Toll-like receptor 9 (TLR9)，Nod-likereceptor family，pyrin domain containing 3 (NLRP3)和 cyclic GMP-AMP (cGAMP) synthase (cGAS)。

线粒体DNA类似于细菌DNA，因其包含非甲基化CpG二核苷酸重复序列，后者可被小胞体受体TLR9识别。一些研究表明，由于受损而释放在胞浆循环中的mtDNA可直接活化TLR9，从而活化NF-kB，产生促炎性因子如TNF-a和IL-61-3。用TLR9抑制性ODNs1，2或敲除Tlr9基因4，被证实可削弱炎症反应，因此证实TLR9参与mtDNA的识别。

另外一个炎症通路，是mtDNA引发形成NLRP3炎症小体。最近发表的数据提示，释放在胞浆中的mtDNA可活化NLRP3炎症小体，导致caspase-1依赖的促炎性细胞因子IL-1b和IL-18的分泌。去除mtDNA可有效抑制IL-1b和IL-18的分泌，即使细胞被炎症小体诱导剂刺激5。此外，氧化的mtDNA被证实可直接结合并活化NLRP36。

线粒体DNA也可活化cGAS-STING启动产生1型干扰素（IFNs）而触发炎性反应。最近的文献表明，在细胞凋亡过程中释放到胞浆的mtDNA可活化cGAS，产生cGAMP，后者招募STING，下游进一步活化TBK1-IRF3信号通路，产生1型干扰素7，8。另有最新研究表明，疱疹病毒感染引起细胞应激而产生的mtDNA也可活化cGAS-STING信号通路9。

mtDNA触发的炎症反应与自噬密切相关。自噬是一种关键的适应机制，多余的胞浆成份（如DNA，蛋白，线粒体和细胞内病原）被双膜泡 （自噬体）“没收”，后者与溶酶体融合，降解其中捕获的胞浆组分，达到清除效果，从而保护细胞避免应激诱导的损伤。另外，自噬可通过调节如NF-kB10和STING11等关键免疫调控器来限制过激的炎症反应。在如微生物感染和重大创伤的病理状态下，功能失调的线粒体和受损mtDNA在胞浆中积累至超出自噬降解能力时，自噬的负向调节功能随之丧失。结果导致炎症反应大幅提升，常伴有慢性炎症的发生，后者由于TLR92，12，NLRP35和（或）cGAS-STING13应答异常而引起。mtDNA在线粒体相关疾病，包括感染疾病，自身免疫病和癌症中的作用机制，还有待于更进一步的研究来解析。

1. Zhang Q. et al., 2010. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury. Nature. 464(7285):104-7.

2. Oka T. et al., 2012. Mitochondrial DNA that escapes from autophagy causes inflammation and heart failure. Nature. 485(7397):251-5.
3. Garcia-Martinez I. et al., 2016. Hepatocyte mitochondrial DNA drives nonalcoholic steatohepatitis by activation of TLR9. J Clin Invest. 126(3):859-64.

4. Wei X. et al., 2015. Cationic nanocarriers induce cell necrosis through impairment of Na(+)/K(+)-ATPase and cause subsequent inflammatory response. Cell Res. 25(2):237-53.

5. Nakahira K. et al., 2011. Autophagy proteins regulate innate immune responses by inhibiting the release of mitochondrial DNA mediated by the NALP3 inflammasome. Nat Immunol. 12(3):222-30.

6. Shimada K. et al., 2012. Oxidized mitochondrial DNA activates the NLRP3 inflammasome during apoptosis. Immunity. 36(3):401-14.

7. White MJ. et al., 2014. Apoptotic caspases suppress mtDNA-induced STINGmediated type I IFN production. Cell. 159(7):1549-62.
8. Rongvaux A. et al., 2014. Apoptotic caspases prevent the induction of type I interferons by mitochondrial DNA. Cell. 159(7):1563-77.

9. West AP. et al., 2015. Mitochondrial DNA stress primes the antiviral innate immune response. Nature. 520(7548):553-7.

10. Zhong Z. et al., 2016. NF-κB Restricts Inflammasome Activation via Elimination of Damaged Mitochondria. Cell. 164(5):896-910.

11. Saitoh T. et al., 2009. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. PNAS;106(49):20842-6.

12. De Leo MG. et al, 2016. Autophagosome-lysosome fusion triggers a lysosomal response mediated by TLR9 and controlled by OCRL. Nat Cell Biol. 18(8):839-50.

13. Lan YY. et al, 2014. Dnase2a deficiency uncovers lysosomal clearance of damaged nuclear DNA via autophagy. Cell Rep. 9(1):180-92.

自噬报告基因细胞

自噬通过溶酶体将包浆物质降解，是维持恒定程序的基本要素。这一多步骤程序包括将物质分离入泡膜，形成自噬体，与溶酶体融合，降解和再循环内容物。研究自噬潮（autophagic flux）的关键蛋白是LC3（微管相关蛋白1轻链3）。在分离膜形成时，胞浆中的LC3被招募并进入自噬程序，此定位动作被视为自噬膜的特征，用以检测自噬的生成和发展。由LC3B融合一个绿色银光蛋白（GFP）和一个红色荧光蛋白（RFP）组成的嵌合蛋白，是检测自噬进程的简单方法。自噬体形成可被RFP-GFP-LC3标记，显示RFP和GFP双信号。与溶酶体融合后，酸性环境可显著降低GFP信号，RFP信号却保持稳定。

HeLa-DiFluo™ hLC3 Cells
RAW-DiFluo™ mLC3 Cells
THP1-DiFluo™ hLC3 Cells

自噬报告基因细胞HeLa-Difluo™hLC3细胞,RAW-Difluo™mLC3细胞和THP1-Difluo™hLC3细胞分别源于人上皮瘤细胞系HeLa，鼠源巨噬细胞系RAW264.7和人源单核细胞系THP-1。这些报告基因细胞全部稳定表达RFP::GFP::LC3融合蛋白（RFP-GFP-LC3）：人源或鼠源LC3的N末端融合两个荧光报告蛋白，RFP（酸性稳定）和GFP（酸性敏感）。在这些报告基因细胞中，通过荧光显微镜检测绿色GFP-LC3和（或）红色RFP-LC3斑点的呈现状态，实现RFP-GFP搭配实时检测自噬潮的功能。在自噬早期，RFP和GFP信号皆可被探知，当进入自噬体与溶酶体融合程序，GFP荧光信号消失，只留下可视的RFP荧光信号。GFP-LC3/RFP-LC3阳性细胞和RFP-LC3阳性细胞的比例可用来评估自噬潮的阶段，这一方法已被报道1，2。

HeLa-Difluo™ hLC3 cells,RAW-Difluo™ mLC3 cells和THP1-Difluo™ hLC3 cells对Zeocin™有抗性。

1. Loos B. et al. 2014. Defining and measuring autophagosome flux- concept and reality. Autophagy. 2014;10(11):2087-96.

2. Kimura S. et al., 2007. Dissection of the autophagosome maturation process by a novel reporter protein, tandem fluorescent tagged LC

3. Autophagy. 3(5):452-60.

HeLa-Difluo™hLC3细胞被25μM rapamycin 单独处理或25μM rapamycin和 500nM bafilomycin A1（抑制自噬体和溶酶体融合）联合处理。孵育24小时，用2% PFA固定细胞，并用共聚焦显微镜分析结果。请注意在图片viii中，黄色（自噬体）和红色（自噬溶酶体）斑点均显著提升，而图片ix中的斑点几乎均为黄色（自噬体）。

自噬诱导剂和抑制剂

自噬是原生分解程序，由细胞内应激物（营养物和能量贫乏）引起。自噬由生成自噬体开始，这一步骤由一系列蛋白调控，包括VPS34的III型磷脂酰肌醇（PI）3激酶复合体，随后与溶酶体的融合将自噬体酸化。自噬的阻断有多种方式，例如III型PI3激酶抑制剂可通过抑制自噬捕获动作而阻断自噬进程，或者用抑制溶酶体酸化的抑制剂阻止自噬溶酶体的形成和自噬降解。自噬进程是被缜密调控的。mTORC1，一种对营养物和生长因子敏感的激酶，是自噬的主要阻遏器。因此，mTORC1及其信号通路的抑制剂可诱导产生自噬。

原代细胞培养的抗菌剂

Primocin™

原代细胞培养，始终要面对来源于原代器官（如，皮肤或肠道样本）或周遭环境中（如实验室，仪器，实验人员等）微生物毁灭性污染的威胁。为了保护您的原代细胞免受污染，InvivoGen开发出一种专利广谱抗生素，Primocin™。

产品描述
Primocin™通过阻断微生物DNA和蛋白合成从而去除支原体，细菌和真菌。Primocin™的作用靶点仅存在于微生物中，包括三个细菌靶点（DNA旋转酶，原核生物核糖体亚单位30S和50S）和一个真菌靶点（麦角固醇，一种仅在真菌和酵母细胞膜发现的分子）。由于特殊的“鸡尾酒”抗生素设计，Primocin™对于某些广泛存在于实验室的细菌（如Pseudomonas aeruginosa,Listeria monocytogenes和Bacillus species）甚至比InvivoGen自主研发的Normocin™处理效果更好。更为重要的是，Primocin™对原代细胞无细胞毒性，这要归功于其抗真菌剂成分与Amphotericin B比，无毒性且更加稳定。

应用及功效
Primocin™在原代细胞分离，培养的文献中高频引用。例如，在外周血单核细胞（PBMCs）中分离原代人源自然杀伤（NK）细胞的亚克隆1；从鼠胚胎脑组织中分离星形胶质细胞和神经元细胞2。另外，最近的研究证明Primocin™处理干细胞污染的功效，如脆性X综合症中人源胚胎干细胞的神经诱导3。在Wang et al.等设计的长期培养人源多能干细胞（hPSCs）方案中，使用Primocin™配合InvivoGen抗支原体制剂Plasmocin™来预防细菌和支原体污染，被视为成功分选和培养的“关键步骤”4。有些科研团队将Primocin™应用于先端生物学领域：3D细胞培养和生物人工脏器。例如，Graham et al. 在研究鼠源生物人工结肠中研究内质网应激（ER stress）而产生炎症和凋亡过程，将Primocin™加入鼠源生物人工结肠培养基，以预防污染5。 类似的研究还有，Weeber和同事用Primocin™确保从结肠直肠癌（CRC）分离的转移活检癌类器官可以正常增殖6。Nichols et al.在从原代成年人肺细胞和儿童肺支架建立肺类器官时两次使用Primocin™：处理肺源组织，以及培样分离的肺器官和气管、支气管细胞7。
虽然Primocin™与其它抗生素完美兼容，但其最大的优点是使用Primocin™时，无需添加其它抗生素。在原代细胞培养中，Primocin™可以处理其它抗生素无法杀死的微生物，消除威胁，无疑是您的最佳选择。例如，最近Cao & Poss在关于斑马鱼心脏外植体培养的文章中指出，Primocin™可降低最初几天心外膜细胞污染的几率，然而青霉素/链霉素（Pen/Strep）和 Fungizone™（Amphotericin B）的组合并不能避免污染8。
Primocin™也可用于保护无限增殖化细胞系。比如，Pastrana et al.用Primocin™处理293TT，ART，SFT和A549，以确保随后BK多瘤病毒的感染筛选实验不受干扰9。
全世界的研究者都信赖Primocin™保护原代细胞不受支原体，细菌和真菌入侵的功效。也请同时关注InvivoGen其它广谱抗菌剂（请查看相关产品）。

1. Garcia-Beltran et al., 2016. Open conformers of HLA-F are high-affinity ligands of the activating NK-cell receptor KIR3DS1, Nat. Immunol., 17:1067–1074.

2. Grabner GF. et al., 2016. Deletion of Monoglyceride Lipase in Astrocytes Attenuates Lipopolysaccharide-induced Neuroinflammation. J Biol Chem., 291(2):913-23.

3. Telias M. et al., 2015. Functional Deficiencies in Fragile X Neurons Derived from Human Embryonic Stem Cells. J. Neurosci.. 35(46):15295-306.

4. Wang et al., 2016. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression, Nat. Prot., 11(2):327-346.

5. Graham et al., 2016. MEM258 Is a Component of the Oligosaccharyltransferase Complex Controlling ER Stress and Intestinal Inflammation, Cell Rep., 11(13):2955–2965.

6. Weeber et al., 2015. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases, PNAS, 112(43):13308-11.

7. Nichols et al., 2016. Giving new life to old lungs: methods to produce and assess whole human paediatric bioengineered lungs, J. Tiss. Eng. Reg., [Ahead of print].

8. Cao & Poss, 2016. Explant culture of adult zebrafish hearts for epicardial regeneration studies, Nat. Prot., 11:872–881.

9. Pastrana et al., 2013. BK Polyomavirus Genotypes Represent Distinct Serotypes with Distinct Entry Tropism, J Virol. 87(18):10105–10113.