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ProbeTex——肾炎建模相关抗体

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ProbeTex——肾炎建模相关抗体

英文名称 Sheep Anti-Rat Glomerular Basement Membrane (GBM) Serum Sheep Anti-Rat Fx1A Serum (PTX-002S) Sheep Anti-Rat Thymocyte (Thy-1) Serum BioScoutTM FITC-Sheep Anti-Rat Glomerular Basement Membrane (GBM) BioScout FITC-Sheep Anti-Extracellular Matrix (ECM)
中文名称 绵羊抗大鼠肾小球基底膜血清 绵羊抗大鼠Fx1A血清 绵羊抗大鼠Thymocyte (Thy-1)血清 绵羊抗大鼠肾小球基底膜抗体-FITC标记 绵羊抗细胞外基质抗体-FITC标记
货号 PTX-001AGBM PTX-002S PTX-003S BS-001GBM BS-002ECM
规格 25 ml 25 ml 20ml 0.5 ml, 2 mg/ml 0.5 ml, 2.5 mg/ml
存在形式 in 0.02 M phosphate buffered saline PBS, pH 7.3 in 0.02 M phosphate buffered saline PBS, pH 7.3 in 0.02 M phosphate buffered
saline PBS, pH 7.4		 浓缩液 浓缩液
稀释方法 / / / 稀释液: 0.02 M PBS, pH 7.3, 1mg/ml BSA, 2 mM叠氮钠       
稀释比例:1:30 to 1:50 for 常规落射荧光显微镜 
1:100 for 共聚焦显微镜		 稀释液: 0.02 M PBS, pH 7.3, 1mg/ml BSA, 2 mM叠氮钠                    
稀释比例:1:30 to 1:50 for 常规落射荧光显微镜 
1:100 for 共聚焦显微镜
保存条件 –20℃ or below –20℃ or below –20℃ or below 短期: 4 ℃最多保存一个月;        
长期：-20℃及以下最多保存一年		 短期: 4 ℃最多保存一个月;        
长期：-20℃及以下最多保存一年
宿主 Sheep Sheep Sheep Sheep Sheep
反应种属 Rat Rat Rat Rat mouse, human, baboon, bovine, rat, rabbit, monkey
用途 诱发被动型抗肾小球基底膜肾炎，按照如下方法可诱发至少25只rat（体重175-200g） 诱发被动型Heymann肾炎（膜性肾小球肾炎），按照如下方法可诱发至少25只rat（体重175-200g） 诱发系膜增生性肾小球肾炎，按照如下方法可诱发至少25只rat（体重175-200g） 提供参考荧光，以帮助确定上皮细胞、内皮细胞和系膜细胞相对于GBM的位置，适用于多重荧光标记。 提供参考荧光，以帮助确定确定细胞和结构相对于基底膜的位置，适用于肾、肝、肺等部位的多重荧光标记。
实验方法 麻醉rat，将anti-GBM serum注射到尾静脉中，注射时间持续15s以上。疾病的发生是剂量依赖性的，向rat注射足够剂量的抗体是非常重要的，推荐注射剂量为0.4-0.5mL/100g weight。由于抗血清批间差、大鼠来源以及研究者的偏好，建议进行剂量反应研究以确定每个批次的抗血清使用量以达到所需的疾病严重程度。 麻醉rat，按照0.4mL/100g weight将anti-Fx1A serum注射到尾静脉中，注射时间持续15-30s以上。疾病的发生是剂量依赖性的，向rat注射足够剂量的抗体是非常重要的。由于抗血清批间差、大鼠来源以及研究者的偏好，建议进行剂量反应研究以确定每个批次的抗血清使用量以达到所需的疾病严重程度。 麻醉rat，按照0.4mL/100g weight将Anti-Rat Thymocyte (Thy-1) Serum注射到尾静脉中,注射时间持续15s以上。疾病的严重程度是剂量依赖性的，对于更严重的疾病需要注射更多的剂量，如果使用了较大的老鼠应当按比例调整注射剂量，向rat注射足够剂量的抗体是非常重要的。如果实验人员对尾静脉注射操作不熟练，建议在其他鼠中注射生理盐水进行练习。 使用其他指标的一抗孵育样本，清洗后孵育对应的荧光二抗。清洗后使用sheep serum（1：50稀释）或sheep IgG(0.5mg/mL)封闭15min。使用稀释好的BS-001GBM再孵育30-45min。清洗后封片。 使用其他指标的一抗孵育样本，清洗后孵育对应的荧光二抗。清洗后使用sheep serum（1：50稀释）或sheep IgG(0.5mg/mL)封闭15min。使用稀释好的BS-002ECM再孵育30-45min。清洗后封片。
备注 抗血清已经过56℃ 30 min热处理。避免反复冻融。融化后可能存在轻微沉淀，注射前30min需要3,000-5,000RPM离心。未在小鼠中进行验证。 抗血清已经过56℃ 30 min热处理。避免反复冻融。注射前需3,000RPM离心。未在小鼠中进行验证。 抗血清已经过56℃ 30 min热处理。避免反复冻融。融化后可能存在轻微沉淀，注射前30min需要3,000-5,000RPM离心。 融化后可能存在轻微沉淀，使用前5min需要10,000-15,000RPM离心。 融化后可能存在轻微沉淀，使用前5min需要10,000-15,000RPM离心。

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大鼠活体注射建模DAB操作步骤

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大鼠活体注射建模DAB操作步骤

该实验操作指南是将1 型小鼠PFFs (SPR-324) 或1 型人PFFs (SPR-322) 注射到大鼠脑中来产生alpha突触核蛋白病理特征。小鼠PFFs显示出了更强的聚集效果。

使用的动物: 雌性SD (Sprague Dawley) 大鼠

2 uL PFFs 或者单体 (阴性对照) 通过以下两个脑顶叶区的位置注射:

•AP + 1.6, ML + 2.4, DV – 4.2

•AP – 1.4, ML + 0.2, DV – 2.8

30天后, 用生理盐水灌注大鼠然后在大鼠脑冠状平面切开，将中脑与前脑分开。之后两部分都用4% PFA 固定 48 小时.

DAB 操作步骤

材料

•1X TBS (含有和不含有 TX-100的)

•30% H2O2

•柠檬酸缓冲液

•驴血清 (保存在 -20℃; 冻融稳定的)

•一抗: pSYN EP1536Y (Abcam; ab51253)

•二抗: 生物素-SP (long spacer) AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L) (Jackson Immuno; 货号: 711-065-152)

•ABC 试剂 (Vector; 货号: PK-7100)

•DAB 试剂 (Vector; 货号: SK-4100)

•孔板 (规格取决于要染色的区域数量)

•漆刷

•玻璃钩

•漂白剂

•ddH20

•BD Luer-lock 注射器 10 mL

•过滤器 0.22 uM 孔径 (Fisher 货号. SLMP025SS)

•100% EtOH

•Histoclear (用于清理组织)

•显微镜载玻片和盖玻片

•Permount (封片剂)

 

第一天:    (猝灭, 抗原修复, 阻断, 一抗)

-用 1X TBS (震荡, 室温)冲洗切片 5 次以除去冷冻保护剂。

-把切片放到 0.6% H2O2 的 TBS 中，覆盖好，置于操作台20分钟。

*该步骤不要用MESH WELLS*

用 _______ mL TBS, _______ uL 30% H2O2

-用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片3次。

-做抗原修复时, 提前在水浴中预热柠檬酸缓冲液至少15~30分钟。在柠檬酸缓冲液中培养切片一小时，将温度设置为37℃，不要震荡 。

-用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片3次。

-阻断时, 将切片置于 5% 常规驴血清和0.25% Triton-100的TBS 中阻断 1 小时，冷室、震荡。

*注意: 可以使用含有Triton的TBS阻断液 (1 L TBS, 2.5 mL TX-100), 之后只需要向阻断液中加入驴血清来阻断。*

用 _______ mL TBS,

_______ uL 驴血清, _______ uL 10% TX-100

-用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片3次。

-用含 5% 驴血清的 TBS制备一抗溶液，稀释度为1：5000。用锡纸包好切片，和抗体一起在冷室中震荡培养过夜。

用 _______ mL TBS,

_______  uL 驴血清, _______ uL pSYN EP1536Y

第二天:    (二抗, ABC 扩大信号, DAB 染色)

-用 1X TBST (震荡，室温) 冲洗切片3次. 余下的步骤中，需要一直将切片保留在锡纸里，即使是冲洗的步骤。

-用含 5% 驴血清的 TBS 制备二抗溶液，稀释度为1：500。在冷室中培锡纸养盖好的切片2小时，震荡。

用 ______mL TBS,

 ______ uL 驴血清, _______ uL 生物素标记的驴抗兔 IgG

-用 1X TBST (震荡，室温) 冲洗切片3次。

-用 ABC 试剂培养切片 30 分钟 (震荡, 冷室)。

-用 1X TBS 冲洗切片 3 次 (震荡，室温)。

-用 falcon 离心管和 ddH2O制备 DAB 溶液，每 5 mL H2O 加入如下溶液然后涡旋混合:

2 滴缓冲溶液

4 滴 DAB 溶液

2 滴双氧水溶液

*注意: 所有接触过DAB的器具只能用来操作DAB。我们还在通风橱内准备了一个DAB专用的废液缸。使用玻璃钩来处理DAB溶液中的切片而不能用漆刷，并且操作后要用漂白剂冲洗玻璃钩。盛装过DAB的器皿都需要用漂白剂冲洗并且处理到生物性危害箱中。*

-用注射器过滤到新的6孔板中。每一个需要染色的脑切片都用一个新的DAB孔。

-在DAB中培养每个切片直到变为浅棕色 (2-3 分钟就足够; 时间太长可能会造成背景染色太多)

-用 ddH2O 冲洗 3 次

-在 1X TBS 中封片，然后在切片柜中干燥过夜。

第三天:    (脱水和盖玻片)

*注意: 在开始脱水步骤之前，确保浸片用的玻璃皿里有足够的液体可以盖过切片上的所有组织。*

-按照如下顺序和时间脱水切片：

1. 30 秒 ddH20

2. 3 分钟 70% EtOH

3. 3 分钟 95% EtOH

4. 3 分钟 95% EtOH

5. 3 分钟 100% EtOH

6. 3 分钟 100% EtOH

*置于振荡器*

7. 5 分钟 Histoclear

8. 5 分钟 Histoclear

9. 5 分钟 Histoclear

-将切片从切片篮从取出，一次一片，置于吸水纸上。

-加封片剂时，取一个P1000 移液器和吸头，将吸头尖剪掉，容量设到400到500 μL.

-连续滴几滴封片剂 Permount 到切片的中间，倾斜切片使封片剂完全覆盖切片。

-用棉棒的木头一端赶出切片中的气泡。

-将切片放在吸水纸上，置于操作台上过夜晾干。

*注意: ~24 小时之后, 多余的Permount 封片剂应该用Histoclear移除*

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