MagCapture™ 外泌体提取试剂盒试剂盒-Wako富士胶片和光
MagCapture™ 外泌体提取试剂盒
MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS采用磷酯酰丝氨酸（PS）亲和Tim4蛋白固化磁珠（PS亲和法）的方法可以简便快捷地提取高纯度的完整外泌体和其他细胞外囊泡（EVs）。如果想要得到更高纯度的外泌体，请使用10,000×g离心后的上清。
该试剂盒使用含有EDTA的中性洗脱缓冲液将外泌体完整洗脱下来，所提取的完整外泌体和其他EVs可用于不同实验。
新型亲和法外泌体提取试剂盒
MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS
MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS采用磷酯酰丝氨酸（PS）亲和Tim4蛋白固化磁珠（PS亲和法）的方法可以简便快捷地提取高纯度的完整外泌体和其他细胞外囊泡（EVs）。如果想要得到更高纯度的外泌体，请使用10,000×g离心后的上清。
该试剂盒使用含有EDTA的中性洗脱缓冲液将外泌体完整洗脱下来，所提取的完整外泌体和其他EVs可用于不同实验，包括电镜分析（TEM）、纳米粒子追踪（NTA）分析、投喂实验、分子组成（蛋白质、脂质、核酸等）分析等。
◆膜表面磷酯酰丝氨酸（PS）亲和法
Tim4蛋白固化磁珠，在金属离子存在的条件下亲和细胞外囊泡表面的磷酯酰丝氨酸（PS），然后使用含有EDTA的洗脱液进行洗脱，捕获高纯度的完整细胞外囊泡
◆优点・特色
使用新型亲和提取方法
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● 通过PS亲和分子回收
● 低背景值
● 在中性条件下通过螯合试剂进行温和洗脱
※ 可获得高纯度，完整的外泌体
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无需进行超离
● 使用磁珠改进了操作
● 流程优化
※ 高重复性
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与其他提取方法相比
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方法
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外囊泡纯度
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囊泡状态
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可操作性
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回收量
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PS亲和法
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完整
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简便稳定
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■■■
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超速离心法
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■■
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完整
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简便
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■■
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聚合物沉淀法
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■
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完整
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简便快捷
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■■■■
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密度梯度离心法
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■■■■
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完整
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复杂
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■■
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抗体亲和法
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■■■
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不完整
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简便稳定
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■■
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样品类型：细胞培养上清、血清、血浆、尿液等。
● 可以纯化高纯度和完整的细胞外囊泡
● 可以从细胞上清液、血清、血浆和尿液中纯化外囊泡
● 重复性高，回收量稳定
● 简易操作（约3.5小时）
● 启用多个样品（无需超速离心）
◆试剂盒组成
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产品名称
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包装规格
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保存条件
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MagCapture™
Exosome Isolation Kit PS
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10次
（产品编号：293-77601）
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2次
（产品编号：299-77603）
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2-10°C
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试剂盒成分
(1) 链霉亲和素磁珠
(2)生物素标记的外泌体捕获
(3)外泌体捕获免疫固定缓冲液
(4)外泌体结合增强剂(×500)
(5)洗涤缓冲液
(6)外泌体洗脱缓冲液
(7)反应管
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<10 次>
600 μL×1 管
100 μL×1 管
35 mL×1 瓶
500 μL×1 管
75 mL×2 瓶
5 mL×1 瓶
22 管
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<2 次>
120 μL×1 管
20 μL×1 管
7 mL×1 瓶
100 μL×1 管
30 mL×2 瓶
1 mL×1 瓶
1 管
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*每套试剂盒能完成5次回收实验，即实际使用量为10×5次/Kit与2×5次/Kit
◆案例•应用
从血清、血浆、尿液中提取的细胞外囊泡的分析
从人血清中提取外泌体的产量比较
使用该试剂盒，超离法和抗体亲和法提取人血清的外泌体，接着用CD9和CD63抗体进行免疫印迹实验。
● 检测抗体
抗CD9兔多抗，System Bioscience公司
抗CD63兔多抗，System Bioscience公司
● 免疫印迹（WB）数据
各样品结果相当于150 μL的血清样本。从100 μL提取物中取出15 μL，添加5 μL的4×SDS样品缓冲液，全部上样。
从人EDTA血浆中提取外泌体
分别从1 mL的EDTA血浆、EDTA血浆（超滤更换缓冲液）、人血清中提取外泌体，进行WB检测（抗Flotillin2抗体）。
● 检测抗体
抗Flotillin-2小鼠单抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience公司
● 使用样品量
各1 mL
● 免疫印迹（WB）数据
各样品结果分别对应150 μL样品量。从100 μL提取物中取出15 μL，添加5 μL的 4×SDS样品缓冲液，全部上样。
从人尿液中提取外泌体的回收量比较
1 mL人尿液分别通过本试剂盒、聚合物沉淀法、超离法进行外泌体回收，并做免疫印迹（WB）检测（抗CD9抗体）。
● 检测抗体
抗CD9兔多抗，System Biosciences公司
● 使用样品量
各1 mL
● 免疫印迹（WB）数据
各样品结果分别对应150 μL尿液样品。从100 μL提取物中取出15 μL，加入5 μL的 4×SDS样品缓冲液，全部上样。
◆与传统沉淀法的功能比较实验
分别用本试剂盒、超离心法和聚合物沉淀法从K562（人慢性骨髓性白血病）细胞培养上清（无血清培养上清或10%Exosome-depleted FBS添加培养基）提取外泌体，分别比较三种方法的外泌体回收量和外泌体纯度。
MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS【PS亲和法】
按照试剂盒的操作说明（反应时间：3小时），从1 mL经过离心处理（10,000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）中提取外泌体。
超速离心法
将10 mL经过离心处理（10,000×g，30 min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）进行超离（110,000×g，70 min），用TBS缓冲液重悬沉淀物后，再进行超离（110,000×g，70 min），回收沉淀部分。
聚合物沉淀法
从1 mL经过离心处理（10,000×g，30 min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）中，按照市售的A公司产品的操作说明（静置时间：过夜）提取外泌体。
※1：110,000×g离心2小时，在不吸到沉淀的前提下回收上清。
比较提取的外泌体的透射电子显微镜（TEM）分析结果和纳米粒子追踪（NTA）分析结果
分别用本试剂盒、超离法、聚合物沉淀法提取外泌体，用NanoSight LM10检测外泌体片段的粒子直径。另外，用终浓度为2%的多聚甲醛固定提取到的外泌体片段（2~4×1010 particles），在透射电子显微镜进行分析。
电子显微镜图像 数据提供：金泽大学 医学系 华山教授、大阪大学 iFReC 中井先生
MagCapture™ 可提取到很多100 nm左右的粒子，在透射电子显微镜中也可以确认到很多细胞外囊泡。
K562细胞培养上清提取的外泌体回收量和纯度的比较（无血清培养基）
用PS亲和法、超离法和聚合物沉淀法从K562 细胞培养上清（无血清培养基）获得样品进行电泳。接着用银染色和WB法（CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗体）进行实验。
回收量，不是回收率
● 检测抗体
抗CD63小鼠单抗（MEM-259）
抗Flotillin-2 小鼠单抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司
抗Lamp-1小鼠单抗 （25/Lamp-1），BD Bioscience公司
K562细胞培养上清提取外泌体的回收量和纯度的比较（10%FBS-添加培养基）
用MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 、超离法和聚合物沉淀法，从K562 细胞培养上清（10% 去外泌体 FBS补充培养基）获得样品进行电泳，用银染法和WB法（CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗体）进行实验。同时，对外泌体提取片段进行质谱测定，比较所有测定的多肽中来自K562细胞的人来源多肽的比例（由于添加到细胞培养基的FBS中牛蛋白聚集体是混杂的，所以人来源多肽的比率会下降）。
● 检测抗体
抗CD63小鼠单抗（MEM-259）
抗Flotillin-2小鼠单抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司
抗Lamp-1小鼠单抗（25/Lamp-1），BD Bioscience公司
健康人血清来源的外泌体中提取miRNA和mRNA的回收量比较
实验数据
①运用不同方法提取外泌体并比较从中提取的microRNA和mRNA的回收量
通过超离法和PS亲和法将EVs从正常人血清中分离，然后使用microRNA提取试剂盒（产品编号295-71701）提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA，并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。
相比超离法，PS亲和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高产量。
②运用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比较
运用PS亲和法将EVs从正常人血清中分离，然后使用microRNA提取试剂盒（产品编号295-71701）或基于AGPC法的试剂提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA，并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。
对比AGPC法，使用microRNA提取试剂盒更能有效提取PS亲和法纯化所得EVs中的microRNA和mRNA
◆外泌体蛋白质组学分析
<实验内容及结果>
分别利用PS亲和法、超离法、聚合物沉淀法，从含10% FBS（不含外泌体）的K562细胞培养上清液中提取外泌体。将提取样品用10%聚丙烯酰胺电泳分离，剪切出全部的蛋白质条带。然后在凝胶内进行消化，用LC-MS对蛋白质进行检测。对上述三种方法提取的外泌体进行蛋白质组合的相关性比较。
比较通过MASS分析鉴定的*个蛋白质
白色柱：源自外囊泡的人类蛋白质
灰色柱：来自FBS的牛蛋白污染物
红色：来自外囊泡的标记蛋白
样品：K562细胞培养基（含有10%去除外泌体胎牛血清）
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PS亲和法
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超离法
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聚合物沉淀法
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1
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71 kDa热休克同源蛋白
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DNA依赖蛋白激酶催化亚基基因
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补体C3
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2
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膜联蛋白A6
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铁转蛋白受体1
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α2-巨球蛋
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3
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铁转蛋白受体1
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血清白蛋白
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纤连蛋白
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4
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V-ATP酶A亚基
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ATP依赖RNA解旋酶
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血清白蛋白
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5
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浮舰蛋白-2
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微管蛋白β5
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血小板反应蛋白-1
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6
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程序性细胞死亡6互作蛋白
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71 kDa热休克同源蛋白
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补体C4
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7
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细胞表面抗原4F2重链
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脂肪酸合成酶
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α-1抗蛋白酶
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8
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膜联蛋白A1
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细胞表面抗原4F2重链
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载脂蛋白-β-100
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9
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220kDa激酶D相互作用底物
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U5小核核糖核蛋白的解旋酶
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胎儿血红蛋白亚单位
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10
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膜联蛋白A2
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β4微管蛋白
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β5微管蛋白
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成对组合相关性比较
◆应用数据
Protein Assay BCA Kit检测外泌体的蛋白质浓度
Protein Assay BCA Kit是利用二辛可宁酸（BCA）定量检测溶液中的蛋白质浓度的试剂盒，是蛋白质定量检测法中的方法。其原理为，碱性条件下的蛋白质Cu2+ 离子被还原为Cu+。Cu+与BCA形成络合物，即产生紫色螯合物，蛋白质浓度与紫色螯合物颜色深浅有关，通过测定562 nm处的吸光度，并与标准曲线做比照，即可定量溶液中的蛋白质浓度。
利用MagCapture™外泌体提取试剂盒从细胞培养上清液中提取外泌体，通过Protein Assay BCA Kit高灵敏的检测外泌体中蛋白质浓度。
【实验内容及结果】
将通过MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的25 μL外泌体溶液分注于96孔板中，加入 Protein Assay BCA Kit中试剂A和试剂B混合液200 μL。之后60℃孵育30分钟，检测560 nm吸光度（图1）。结果表明，通过Protein Assay BCA Kit的高灵敏度检测，可测定提取后外泌体中蛋白质浓度。
图1. Protein Assay BCA Kit 检测BSA的检量线和提取的外泌体蛋白质浓度的检测
<BCA Assay 操作概要>
由于外泌体蛋白质浓度相当低，因此BCA测定时不要稀释样品。
① 将BSA标准溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625 μg／mL和空白对照，分别每孔25 μL加到96孔板中。
② 分别把提取的外泌体和洗脱缓冲液（空白）按照每孔25 μL加入96孔板。
③ 把200μL Protein Assay BCA Kit（产品编号：297-73101）的试剂A盒试剂B混合液（A:B=50:1）加入放有样品的孔板中。
④ 60℃孵育30分钟
⑤ 室温条件下降低孔板温度
⑥ 测定560 nm的吸光度
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产品编号
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产品名称
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包装
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297-73101
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蛋白测定试剂盒（二喹啉甲酸）
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250次用
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015-25613
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2 mg/mL 牛血清蛋白溶液
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1 mL×10
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◆外泌体的标记和Hela细胞导入实验
【实验概要】
用PKH67（Sigma公司）标记MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的细胞外囊泡， Hela细胞导入确认
<外泌体PKH67标记>
1. MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取外泌体（实验当天从K562细胞培养上清液提取外泌体）
2. 用BCA Assay和NanoSight检测样品的蛋白质浓度和粒子浓度
3. 将相当于5 μg*蛋白量的外泌体样品溶液分装至1.5 mL管中。
*请配制合适的使用量
4. 将2.0 μL的PKH linker溶解在0.25 mL的DiluentC中。…4×Dye solution*
*请配制合适的使用量
5. 添加1/3样品量的4×Dye solution至样品中，混合后在室温中孵育5-10分钟。
6. 根据附带的操作说明用PBS平衡Exosome Spin Columns （MW 3000）（Thermo公司）。
7. 将100 μL样品分别加入上述平衡后的旋转柱*中，离心（大添加量：100 μL）。
*准备必需的支数。
8. 将外泌体溶液*加入到已经接种好Hela细胞的培养皿中，24小时后用显微镜观察并利用流式细胞仪进行分析。
*根据实验调节外泌体添加量
图1. PKH标记外泌体的细胞捕获观察
从16 mL K562培养上清液中超滤浓缩得到4 mL培养上清液作为样品，通过PS亲和法提取外泌体。
● 提取的外泌体蛋白质浓度：22.3 ng/μL
● 粒子浓度：1.2×108 particles/mL
将上述标记的外泌体溶液全部加入接种好的Hela细胞中，24小时后用荧光显微镜（左）和流式细胞仪（右）检测捕获情况。
Opti-MEM：取相同量用PKH标记后添加到细胞中作为阴性对照。
◆细胞培养上清•血清•血浆的预处理操作
样品预处理：对样品进行1,200×g离心操作※1。如果要得到更高纯度的外泌体，则按照下述步骤对样品进行10,000×g离心操作※2。
下文是细胞培养上清、血清/血浆的预处理方法。其他体液样品的预处理操作，请参考血清/血浆的实验步骤，做适当调整。
更换缓冲液（限制过滤）操作
用50 mL TBS 缓冲液对1 mL 已经经过离心处理的EDTA 血浆样品进行缓冲液更换。
1. 把19 mL TBS 加进VivaSpin20（100K）中。
2. 把1 mL 离心过的EDTA 血浆上清添加在第1. 的VivaSpin20（100K）中，混匀。
3. 把第2. 的VivaSpin20（100K）在4℃下进行离心处理。
4. 减少上线的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 缓冲液。
5. 4℃下离心处理。
6. 减少上面的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 缓冲液。
7. 4℃下离心处理。
8. 减少上面的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加11 mL TBS 缓冲液。
9. 4℃下离心处理直至样品液量达到1 mL 以下。
10. 进行提取。
◆MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 操作步骤
◆产品列表
| 产品编号 |
产品名称 |
包装 |
| 293-77601 |
Exosome外泌体提取试剂盒PS |
10次用 |
| 299-77603 |
2次用 |
◆相关产品
| 产品编号 |
产品名称 |
包装 |
| 016-27061 |
抗CD63单抗（3-13） |
20 μL |
| 012-27063 |
抗CD63单抗（3-13） |
100 μL |
| CAC-SHI-EXO-M02-50UL |
CD63 外泌体提取抗体 |
50 μL |
| CAC-SHI-EXO-M01-100UL |
外泌体分离抗体CD9 |
100 μL |
| CAC-SHI-EXO-M02-100UL |
外泌体分离抗体CD63 |
100 μL |
| CAC-SHI-EXO-M03-100UL |
外泌体分离抗体CD81 |
100 μL |
| CSR-SHI-EXO-K010 |
外泌体分离亲和柱套装，蛋白研究用
|
1 kit |
| 290-35591 |
MagCapture系列磁珠捕获用磁力架 |
1个 |
MagCapture™ 外泌体提取试剂盒
