RNase 4 是一种单链核糖核酸内切酶，在尿苷-嘌呤序列（切割位点：U/A 和 U/G）中尿苷的 3´ 端产生切割。与单核苷酸特异性 RNase 相比，例如 T1（切割位点：G 后）、RNase U2（切割位点：A 和 G 后）或牛胰腺 RNase A（切割位点：C 和 U 后），RNase 4 可以对底物 RNA 的消化更有针对性。RNase 4 可耐受修饰的尿苷，例如假尿苷、N1-甲基-假尿苷、二氢尿苷和 5-甲氧基-尿苷（Ψ、m1Ψ、D 和 mo5U）。受 RNase 4 酶解化学机制的影响，寡核苷酸产物具有异源 3´ 端，其中大多数为 3´-磷酸或 2´,3´-环磷酸。

 图2：在 LC–MS/MS 技术中使用 RNase 4 可对 mRNA 进行全面的分析

 

A：RNase 4 消化实验流程示意图。RNA 样品在 3 M 尿素（用户自备）中，90℃ 加热变性 10 分钟。尿素浓度稀释至 1 M 后，在 1X NEBuffer™ r1.1（NEB #M1284）中进行反应。NEBuffer r1.1 以 10X 原液形式提供。消化得到的寡核苷酸库直接用于 LC–MS/MS 分析。B：分别使用 RNase 4 或 RNase T1 对 FLuc mRNA 进行两次独立消化实验，获得具有代表性的序列覆盖图谱。FLuc mRNA 由 HiScribe^®  T7（NEB #E2040）试剂盒合成。覆盖图谱中的彩条表示寡核苷酸匹配到参考序列（X 轴）的特定位置。图中标注了序列覆盖度百分比。

 

图 4：使用 RNase 4 进行 mRNA 5´ 端分析的实验流程概览

 

1：在选定的 UA 或 UG 切割位点上游，设计生物素标记的 DNA 寡核苷酸探针，使其与 RNA 的 5´ 端杂交。由于 RNase 4 具有单链 RNA 特异性，因此 DNA:RNA 杂交双链区内的潜在切割位点都会受到保护而阻碍切割。2：RNase 4 消化后，可以通过链霉亲和素磁珠（NEB #S1420）捕获探针杂交的 mRNA 5´ 端产物。3：洗脱富集到的 DNA:RNA 双链，并进行 UHPLC–MS/MS 分析

 

图5：使用 RNase 4 进行 mRNA 5´ 端分析时，使实验设计和数据处理变得简单

 

 

A：RNase H 的切割位点特异性难以预测，与其相比，RNase 4 在切割位点的选择上更灵活，且特异性更好。此外，RNase H 实验流程需要精心设计和优化嵌合的 RNA-DNA 探针，而 RNase 4 实验流程仅使用 DNA 探针。通过 5´ 端或 3´ 端偶联生物素或脱硫生物素，可以在 LC–MS/MS 分析之前通过链霉亲和素富集探针杂交的片段。B：如图 A 所示，使用 RNase 4 或 RNase H 对 FLuc mRNA 进行两次独立实验，获得的 5´ 端切割产物的代表性热图。C：预估 5´ 端加帽产物及其中间体的分布情况。误差条代表两个独立实验的标准差。

 

图 6：根据 RNA 的序列和修饰情况调整反应条件，RNase 4 可以获得更好的比对结果

 

图中显示了长度为 878（红色）或 4,938 个核苷酸（蓝色）的 RNA 的结果。使用 HiScribe T7 高效 RNA 合成试剂盒（NEB #E2040），用同源 m1φTP 代替 UTP，通过体外转录合成长度为 4,938 个核苷酸的 m1φ 完全取代转录本（黄色）。为了获得最大的序列覆盖率，应根据经验确定 RNase 4 的用量，这与其他用于 LC–MS/MS 序列比对的 RNase 类似。一般来说，长度更长和修饰更多的 RNA 需要更多单位的酶才能获得最佳的比对覆盖度。然而，若 RNase 4 过量使用或温育时间过长，未必能获得最高的序列覆盖度，反而可能导致假消化。RNase 4（NEB #M1284）以 50 U/µl 的溶液形式提供。