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细胞凋亡早期检测的四种方法

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细胞凋亡早期检测的四种方法

细胞凋亡早期检测的四种方法，请查看本文具体内容介绍：

1、PS（磷脂酰丝氨酸）在胞外膜分布的检测

PS从胞膜内侧转移到外侧现象是在细胞凋亡的早期即可发生标志。AnnexinV是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在胞膜外侧的PS，使用荧光素标记的AnnexinV 蛋白（如Annexin V-FITC）即可检测细胞凋亡。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用），可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。操作简便快速，10分钟就可完成检测。灵敏度高，可作为流式方法分析凋亡细胞的基础。

2、细胞内氧化还原状态改变的检测

正常状态下,谷胱甘肽（GSH）作为细胞内的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而清除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被消化除。在细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。

3、细胞色素C的检测

细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，而不存在于胞浆内。凋亡信号刺激后可使其从线粒体释放到胞浆中，结合Apaf-1后而启动caspase级联活化反应，首先可激活caspase-9，后者再激活caspase-3和下游的其它caspase分子。凋亡发生的早期，细胞色素C泄漏到胞浆中，检测胞浆中细胞色素c的含量可反映细胞的早期凋亡。

4、线粒体膜电位变化的检测

在细胞凋亡的早期，线粒体在形态学上没有明显变化。但线粒体可发生很多生理生化的改变。例如在受到凋亡诱导后，线粒体的转膜电位发生变化，导致膜穿透性改变。MitoSensorTM是一种阳离子染色剂，对此膜电位改变非常敏感，可呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中，因线粒体跨膜电位改变，它则以单体形式停留于胞浆中，发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。

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细胞增殖检测最合适的四种方法

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细胞增殖检测最合适的四种方法

细胞增殖检测的应用相当广泛，不论是测试药物试剂还是生长因子的效果，不论是评估细胞毒性还是分析细胞活性状态，您都可能会用到它。细胞增殖检测一般是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。细胞增殖检测主要分为四类：DNA合成检测、代谢活性检测、细胞增殖相关抗原 检测和ATP浓度检测。在这些方法中作何选择，主要取决于您所研究的细胞类型和研究方案。

DNA合成检测

DNA合成检测是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。传统方法是，将放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育几小时或者孵育过夜。这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器SC检测。该方法时间耗时长而且还有个明显的弊端，那就是使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。不过，您还可以使用5-溴-2-脱氧尿苷BrdU来进行类似实验，因为BrdU也同样可以掺入到新合成的DNA中。不过这样就需要进行额外的实验步骤，先孵育特异性BrdU单抗和带标记的二抗，然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。该方法的好处就是让您不需要再和放射性物质打交道。BrdU标记很适合免疫组化 IHC、免疫细胞化学IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。

代谢活性检测

检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。在细胞增殖过程中乳酸脱氢酶的活性会增加，因此四唑盐或者Alamar Blue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。您可以通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪 来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。

四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1。MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶体需要溶解在DMSO或者异丙醇中。因此，MTT主要作为终点检测方法。其他三种盐与Alamar Blue一样，都是可溶且无毒的。它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。其中XTT的效率较低，需要添加额外的因子。而WST1更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色。Alamar Blue的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有100个细胞它就能够检测到。四唑盐和Alamar Blue氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究，非常方便。它们适用的检测仪器包括：标准分光光度计、荧光分光光度计和酶标仪等。

增殖标志检测

有些抗原 只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。

ATP检测

细胞内的ATP含量受到了严格调控，检测ATP也可以得到细胞增殖的信息。死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP，在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素luciferin的ATP检测以生物发光为基础，能够为您提供非常灵敏的结果。如果有ATP存在荧光素酶就会发光，而且其发光强度与ATP浓度成正比，用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。

怎么选择最合适的细胞增殖检测方法呢？

怎样选择最适合自己的检测方法，这依赖于您的细胞类型和研究方案，当然还取决于您在细胞增殖中期望得到的信息。举例来讲，假如您已经有了待测细胞(不论是在培养板还是在溶液中)，希望了解细胞增殖中的代谢活性变化，那您可以使用四唑盐和比色法检测。相应的，如果您对DNA合成的改变更感兴趣，可以选择用BrdU标记，再通过比色法、化学发光或荧光检测进行分析。若您研究的是单个细胞，也可以用BrdU标记来检测DNA合成，将其与荧光标记的相应抗体结合，您就可以通过流式细胞仪来进行流式分选。

本文介绍的四种方案都是久经考验的可靠方法，选择最适合自己的检测方式，好结果自然水到渠成。

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研究细胞健康的四种常见表现形式

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研究细胞健康的四种常见表现形式

确定细胞的健康状况是确保实验准确性的关键因素，也可以是实验结果。无论您是在确定培养细胞的生存能力、增殖反应、候选药物或药物是否会导致细胞凋亡或自噬，还是只是想改善流式细胞术数据，这些都是细胞健康相关的研究。

研究细胞健康的四种常见表现形式有：

1.细胞活力——是毒性分析中的主要实验数据，一般基于研究对象的浓度梯度来准确展示细胞活性变化。另外也可用做其它研究的前提，确保正在研究的对象是活细胞；

2.细胞增殖——细胞生长和分裂的增加或减少是细胞毒性和凋亡检测的关键。另外可用于确定实验条件或治疗方案对细胞复制的影响；

3.细胞凋亡——凋亡是以细胞内明显的形态和生化变化为特征的程序性细胞死亡过程。这对调节免疫反应和发育至关重要，和癌症研究也是息息相关；

4.自噬——自噬是细胞质通过溶酶体降解和循环的有序过程。饥饿或生长因子抑制、内质网应激、感染或免疫信号变化都可以引起自噬。自噬被认为是应激和感染期间的一种修复和生存反应，与细胞凋亡密切相关。

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