免疫细胞化学实验操作指南

该免疫细胞化学实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。

所需试剂

PBS 洗涤液. 磷酸盐缓冲液 (PBS). 使用 10x PBS, pH 7.2 (0.2M 磷酸钾, 1.5M NaCl). 用适量去离子水稀释到1x.

甲醛固定. 用PBS稀释到 4%.

抗体稀释液. 制备100ml 的PBS 洗涤液，加入1ml 与二抗宿主同物种的正常血清.

生物素化的二抗. 在抗体稀释液中制备生物素化的二抗溶液. 使用抗一抗宿主的生物素化的二抗.

链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶. 在PBS缓冲液中制备链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液.

DAB 底物.

苏木精复染色以及固定介质.

步骤

将细胞生长于显微镜载玻片，或盖玻片，或细胞培养板上。除去培养基液，用冰冷的PBS小心清洗细胞3次。用含4%甲醛的PBS溶液于冰上固定细胞30分钟，使用的甲醛溶液应与最初培养基液体积相等。弃去固定液，用PBS冲洗3次每次5分钟。如需要，可在含1% H2O2 的PBS溶液中孵育5分钟，以除去内源的过氧化物酶活性。用PBS清洗固定的细胞3次，每次5分钟。

用抗体稀释液制备适宜浓度的一抗溶液。移去细胞上的缓冲液。加入足够量的一抗使其覆盖细胞。室温下孵育一抗60分钟。如果一抗与抗原的亲和力较低，可于4?C下过夜孵育。移去一抗溶液。用PBS清洗3次，每次5分钟。

移去细胞上的缓冲液。加入稀释的生物素化的二抗，室温下孵育30分钟。最佳的稀释度每个批次二抗有所不同。用PBS清洗3次，每次5分钟。

移去细胞上的缓冲液。加入稀释的链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶，室温下孵育30分钟。移去溶液。 用PBS清洗3次，每次5分钟。

移去缓冲液。加入DAB底物，孵育大概10分钟或者直到反应颜色足够深。

移去溶液。用蒸馏水清洗3次，每次2分钟。用苏木精复染色，根据浓度和所需颜色深度的不同，染色1至5分钟。用蒸馏水清洗3次，每次2分钟。用100%的乙醇给细胞脱水4次，每次2分钟。用二甲苯清洗细胞4次每次2分钟。加入2~3滴固定介质，固定好盖玻片使之风干。

在显微镜下观察细胞。阳性反应应是可见的棕色沉淀。细胞核应显浅蓝色。

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免疫组织化学选择指南

一、选择合适的一抗

• 选择感兴趣特定抗原的抗体

• 考虑组织切片的种类和制备 (固定)

• 考虑抗原修复条件

二、选择合适的二抗和三级检测系统

• 选择HRP或AP酶检测系统

• 考虑检测灵敏度需求

• 考虑一抗种属

• 考虑组织切片种类

三、选择合适的酶底物

• 颜色

• 与其他检测系统试剂兼容性（用于多重染

 色的复染试剂、封片剂和其他底物试剂等）

四、选择核复染染料

• 蓝色、绿色或红色

• 与底物、封片剂的兼容性

五、选择封片剂

• 水溶性 vs 非水溶性

• 与底物和复染试剂的兼容性

六、观察

• 使用显微镜明场视野进行观察

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细胞培养污染指南

更多详情请联系InvivoGen中国代理商上海金畔生物

免疫组化故障排除指南（解决方案）

很多科研的小伙伴在做免疫组化实验时，可能会遇到一些奇奇怪怪的问题，本篇小欣整理了免疫组化故障排除指南，大家可以根据下列的免疫組化故障排除指南来快速找出问题原因，改善您的实验步骤和解决方案。

首先可以从下面几个情况中找到您的免疫荧光染色的问题所在：

一、染色较弱或无染色

可能存在的问题及解决方案：

一抗量不够：

增加抗体浓度

延长孵育时间

一抗二抗不兼容：

二抗应该是抗一抗宿主的。例如，如果一抗是小鼠来源的，那就需要用抗小鼠的二抗

亚型需要兼容

待测组织干透：

在整个染色过程中都需要使样品完全被覆盖于溶液中。

细胞没有通透：

用甲醇或者丙酮固定可以通透细胞

如果使用甲醛固定，用0.2% Triton X-100通透细胞

脱蜡不充分：

加长切片脱蜡时间

确保使用新鲜配制的二甲苯

一抗不适用：

确保抗体被验证过适用于对应类型的IHC, 福尔马林固定, 石蜡包埋, 新鲜冻存切片等等。

• 使用WB先检测抗体，确保抗体没有变质。

组织过度固定：

减少固定的时间

做抗原修复以显现抗原表位

孵育时间太短：

增加一抗和样品孵育的时间

切片储存问题：

样品染色后应该尽快观察，否则信号会随时间减弱。如需要的话，将切片保存在 4⁰C 黑暗处。

抗体储存问题：

反复冻融是对抗体不利的，可引起降解. 最好是在收到产品时将其分成多个小份来保存。

抗体没有按照建议的方式保存. 如果是这样的话可能需要重新购买一支。

如果二抗没有在黑暗处保存 (使用免疫荧光时), 应更换一支新的二抗。

蛋白没有在检测的组织中出现：

做一个阳性对照

如果目标蛋白显现但是信号不强, 增加一个扩大信号步骤

二、高背景染色

可能存在的问题及解决方案：

脱蜡不充分：

加长切片脱蜡时间

确保使用新制的二甲苯

内源的过氧化物酶活性：

如果使用的是HRP检测系统，在进行染色步骤前用3% H2O2 降低内源过氧化物酶活性

内源的生物素：

如果使用的是生物素检测系统，而样品中内源生物素水平又很高 (例如. 肾脏，肝脏，胰脏)，那么需要先使用抗生物素蛋白孵育样品来封闭内源生物素，再进行正常的封闭步骤，然后在一抗孵育前再用生物素封闭。

抗体浓度太高：

进一步稀释一抗/二抗

非特异性结合：

做一个没有一抗的二抗空白对照.  如果有染色，说明二抗有非特异性结合，更换一种二抗，或者使用标记一抗

封闭不充分：

增加封闭孵育时间或考虑更换封闭液。

信号放大过度：

减少信号放大孵育时间，稀释二抗

洗涤不充分：

步骤之间的适当洗涤非常重要. 确保遵循说明说上的洗涤步骤

组织切片太厚：

考虑使用更薄的切片，因为过厚的切片超过了共焦平面的部分会造成过度的背景染色

三、非特异性染色

抗体浓度过高：

降低抗体的浓度和孵育时间

一抗宿主与要染色的组织来源是同一物种 (例. 小鼠抗小鼠的一抗):

• 尝试使用来自不同物种的一抗。或者尝试用二抗宿主的血清来阻断内源的IgG 。或者用 1% Triton 孵育切片以清理组织。或者使用 TBS-Tween 20作为洗涤液而不是用 PBS-Tween 20。

如以上内容未能解决您的需求，可联系我们上海金畔生物相关技术同事，帮您解疑答惑。

免疫印迹实验操作指南

该免疫印迹实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。

阻断

1.使用 5% 脱脂奶粉溶于 1X TBST 作为阻断缓冲液.

2.使用足够多的阻断缓冲液确保凝胶被完全覆盖.

3.室温下阻断并震荡1小时.

冲洗

1.1X TBST 中冲洗3次，每次4分钟，然后1X TBS中冲洗 3次，每次4分钟.

2.确保在盒子里一直都有足够的冲洗缓冲液.

一抗孵育

1.将一抗在 TBST中稀释.

2.室温下震荡孵育 2 小时.

3.时而检查凝胶确认其完全被抗体溶液覆盖.

冲洗

1.1X TBST 中冲洗3次，每次4分钟，然后1X TBS中冲洗 3次，每次4分钟.

2.确保在盒子里一直都有足够的冲洗缓冲液.

二抗孵育

1.在1X TBST (浓度根据使用的抗体而定) 中制备二抗.

2.室温下震荡孵育 1 小时.

3.时而检查凝胶确认其完全被抗体溶液覆盖.

冲洗

1.1X TBST 中冲洗3次，每次4分钟，然后1X TBS中冲洗 3次，每次4分钟.

2.确保在盒子里一直都有足够的冲洗缓冲液.

检测

ECL检测试剂的用量取决于凝胶的大小. 通常来说, 用量需要足够完全覆盖凝胶.

1.1:1 混合溶液 A 和溶液 B.

2.用镊子夹起凝胶，轻轻拍在无尘擦纸上，去除凝胶上多余的 Tris.

3.把凝胶放在新的干净的盒子里，加入检测试剂，确保凝胶均匀的被覆盖.

4.在黑暗中孵育凝胶 5 分钟.

5.用镊子夹起凝胶，用无尘擦纸洗掉多余的试剂.

6.凝胶成像.

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免疫细胞化学故障排除指南

根据下列的免疫细胞化学故障排除指南来快速找出问题原因，改善您的实验步骤和解决方案。首先从下列选项中找到对应您免疫细胞化学染色问题的图片:

染色较弱或没有染色	高背景染色	非特异性染色

一、染色较弱或没有染色：

细胞从盖玻片上脱离: 减少洗涤步骤或轻缓洗涤；用多聚赖氨酸将细胞黏合到盖玻片上

细胞没有被通透: 甲醇和丙酮固定能使细胞通透性增强；如果使用甲醛, 用0.2% Triton X-100通透细胞

细胞失水变干: 在整个染色过程中样品必须保持覆盖于液体中

细胞固定过度: 减少固定时间

一抗量不够: 提高抗体浓度；加长孵育时间；

孵育时间太短: 增加一抗和样品的孵育时间

切片储存问题: 样品处理之后应该应该马上成像，不然信号会随时间推移而减弱。如果需要可以将切片于 4⁰C 黑暗处储存。

一抗二抗不兼容: 二抗应该是抗一抗宿主的。例如，如果一抗是小鼠来源的，那就需要用抗小鼠的二抗；亚型需要兼容

一抗不适用: 确保抗体验证过可以用于ICC；先在免疫印迹中测试抗体, 确保抗体没有变质

储存问题: 反复冷冻/解冻是对抗体不利的，可引起降解. 最好是在收到产品时将其分成多个小份来保存；抗体没有按照建议的方式保存. 如果是这样的话可能需要重新购买一支；如果二抗没有在黑暗处保存 (使用免疫荧光时), 应更换一支新的二抗。

蛋白没有在检测的组织中出现: 做一个阳性对照；如果目标蛋白显现但是信号不强, 增加一个扩大信号步骤

二、高背景染色

抗体浓度太高: 稀释一抗/二抗

非特异结合: 做一个没有一抗的二抗空白对照.  如果有染色，说明二抗有非特异性结合，更换一种二抗。

阻断不够: 增加阻断孵育时间或考虑更换阻断剂。

信号放大过度: 减少信号放大孵育时间，稀释二抗

洗涤不充分: 步骤之间的适当洗涤非常重要. 确保遵循说明说上的洗涤步骤。

三、非特异性染色

抗体浓度过高: 降低抗体的浓度和孵育时间

一抗产自和待测样本来源同样的物种 (例. 小鼠抗小鼠): 尽量使用来自不同物种的一抗.  或者阻断内源IgG.  还可以尝试在孵育时使用1% Triton 来清洗组织.  或用TBS-Tween 20替换 PBS-Tween 20作为洗涤液。

如有其它问题，请联系Stressmarq代理商-上海金畔生物

免疫组化实验操作指南

该免疫組化实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。

所需试剂

• 丙酮

• 乙醇，无水变性的，组织学分级 (100% 和 95%)

• 蒸馏水

• 苏木精

• 二甲苯

• 10X TBS: 制备 1 升10X TBS：24.2g Tris base, 80g NaCl; 用HCl (使用 1X) 将pH 调至 7.6 。

• 洗涤液 TBS/T: 1X TBS, 0.1% Tween-20: 制备 1 升需将100ml 的 10x TBS 加入到 900 ml 双蒸馏水中。加入1ml Tween 20 然后混合。

• 10 mM 柠檬酸钠缓冲液： 制备 1 升需将 2.94g 柠檬酸钠加入到 1 升的蒸馏水中。将 pH 调至 6.0。

• 3% 过氧化氢： 制备需将10ml 30% H₂O₂ 加入到 90ml 蒸馏水中。

• 封闭液: 5% 马血清或山羊血清溶于TBS

• ABC 试剂: 在使用前30分钟根据制造商说明制备。

• DAB 试剂: 根据制造商说明制备。

组织制备

A. 新鲜冷冻切片

组织制备

1. 在液氮中将组织切成小块 (5 mm x 5 mm x 3 mm)。

2. 转移到恒冷箱切片机中, 切成5–30 μm薄的切片，将切片转移至带正电荷的载玻片上 (poly-L-lysine 包被的).

3. 室温下干燥切片 (若当天染色则干燥1-2 小时，直至完全干燥)。注意：彻底干燥才能保证组织恰当地粘附在切片上。

固定方法

可用的固定方法有很多种. 应遵循产品说明书上指定的方法或找到适宜样品的最佳方案。

• 冷丙酮: -20°C处理10分钟。自然干燥。

• 甲醇: -20°C处理10分钟。

• 10% 中性甲醛溶液: 室温下10分钟。

• 3% 甲醛: 室温下15分钟。

• 3% 甲醛/甲醇: 室温下15分钟，然后用甲醇 -20°C处理 5 分钟 (中间不要漂洗)。

用PBS （pH 7.4 含1% Tween 20）漂洗切片3次，每次5分钟。

B. 固定的, 冷冻组织切片

1. 使组织充满固定剂或将组织浸入到固定剂中一段时间。最常用的固定剂是4% 多聚甲醛。

2. 将组织浸没于冻存保护液（其中含有含10-30%蔗糖的PBS）中。当组织沉入溶液中后冻存保护就完成了。

3. 从冻存保护液中取出组织，保存于 -70°C 直到切片。

4. 将组织从 -70°C 冰箱取出，在-20°C平衡15分钟 然后再切片。-20°C平衡帮助避免切片时的断裂。

5. 用恒冷箱切片机将组织切成 10-15um 的切片，收集切片置于载玻片上。通常每个载玻片可以放置3片切片，留出足够间距。

6. 充分干燥切片。可使用自然风干或切片加热器，通常需要过夜或在40-50°C下至少干燥2~3小时。

7. 制好的切片可以干燥保存在 -70°C 直至染色。 在复水染色前要先平衡至室温并适当干燥。

C. 石蜡包埋切片

脱蜡和水化切片

1. 二甲苯：换 2-3 次，每次5分钟。

2. 100% 纯乙醇：换2次，每次3分钟。

3. 95% 乙醇: 换2次，每次3分钟。

4. 80% 乙醇：3分钟。

5. 50% 乙醇：3分钟。

6. 蒸馏水，PBS，或 Tris buffer：换2次，每次3分钟。

注意: 一旦组织切片复水，不要使之干透。用吸水纸吸干组织切片周围。用钻石划针，免疫組化笔，陶瓷记号笔, 或指甲油在载玻片上将切片圈起来。这个圈可以在接下来的孵育过程中使溶液留存于切片上。

抗原修复

很多抗原的可视性可以通过抗原修复来提高，抗原修复可以打破福尔马林固定时形成的蛋白质交联，从而使被掩藏的抗原显现出来。抗原修复技术包括不同时间长度的加热或者利用蛋白酶来做酶消化，例如蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。

加热的方法通常会用到微波炉，高压锅，蒸箱或水浴。将样品在接近100°C高温加热20分钟后再冷却同等的时间。最常用的抗原修复液有 a) 柠檬酸盐缓冲剂, pH 6.0, b) Tris-EDTA, pH 9.0 和 c) EDTA, pH 8.0.

如需要可用柠檬酸盐缓冲剂做抗原修复：

柠檬酸盐缓冲剂配方:

• 10mM 柠檬酸钠, 0.05% Tween-20, pH 6.0 或

• 10mM 柠檬酸, 0.05% Tween-20, pH 6.0

1. 将含有柠檬酸钠或柠檬酸盐缓冲剂的染色盘放到蒸箱或者水浴中，预热到95-100 °C。

2. 将切片浸没于染色盘中。盖子虚掩，孵育20-40 分钟 (研究者需自己决定最佳的孵育时间)。

3. 关掉蒸箱或水浴，将染色盘置于室温下，让切片冷却20分钟。

4. 在TBS-Tween-20中漂洗切片2次，每次2分钟。

5. 开始封闭步骤。

过氧化氢孵育

阻断内源性过氧化物酶 (如需要):

1.将切片浸入到 0.3-3% H2O2 和 100% 甲醇中，室温下10-30 分钟。

2.在蒸馏水中漂洗切片，换2次，每次5分钟。

免疫组化实验方案

封闭步骤:

1. 用3-10% 来自二抗宿主物种的正常血清孵育切片30分钟，以阻断非特异的抗体结合。

2. 移去封闭液。

一抗孵育

*所有步骤需在湿润的环境中进行。

1. 在封闭液中稀释一抗。如果没有建议的稀释度，从 1:10, 1:100 和 1:1000开始。

2. 4°C 孵育过夜。

3. 移去抗体溶液。用PBS，pH 7.4 洗涤3次，每次5分钟。

4. 如果一抗是HRP-标记的，直接开始显色步骤。

二抗孵育

1. 根据建议的稀释度在封闭液中稀释生物素–标记的二抗。室温下孵育 30-60 分钟。

2. 移去二抗溶液。在洗涤液中清洗3次，每次5分钟。

显色

1. 向每个切片中加入链霉亲和素–辣根过氧化物酶试剂，室温下孵育30分钟。

2. 移去 ABC 试剂。用洗涤液清洗切片3次，每次5分钟。

3. 在湿润的环境下用 DAB 溶液彻底覆盖切片。室温下孵育 5-15 分钟。或者，在显微镜下观察切片来决定最佳的不溶沉淀物颜色深度。

4. 一旦显色，用蒸馏水小心冲洗以终止反应。

5. 如需要可以用苏木精和曙红对组织进行复染色。

6. 用蒸馏水清洗切片。

复水以及加盖玻片

1. 样品复水：使用一系列不同浓度的甲醇或乙醇– 50% (2 x 5 min), 75% (2 x 5 min), 最后 100% (2 x 5 min)。

2. 用二甲苯重复上述步骤，孵育切片两次，每次10秒钟。

3. 使切片自然干燥。

4. 用合适的固定介质固定好盖玻片。

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