免疫组织化学背景小知识
什么是免疫组织化学
免疫组织化学(Immunohistochemistry)或免疫细胞化学(immunocytochemistry), 是应用免疫学基本原理—抗原抗体反应, 即抗原与抗体特异性结合的原理, 通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质), 对其进行定位、定性及定量的研究技术。
免疫组化将免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来, 借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用, 在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体及受体等)。
免疫组化标本
实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类, 前者包括石蜡切片和冰冻切片, 后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法, 对于组织形态保存好, 且能作连续切片, 有利于各种染色对照观察; 还能长期存档, 供回顾性研究。石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响, 但可进行抗原修复, 是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
免疫组化检测方法
>>直接法
直接法又称一步法, 采用带标记的抗体(如FITC)直接作用于组织切片上的抗原。该技术仅需一种抗体, 流程简短、快速。但因为没有信号放大系统, 直接法灵敏度不高。随着间接法的引入, 直接法应用逐渐减少。
>>PAP法
PAP(peroxidase anti-peroxidase), 即过氧化物酶-抗过氧化物酶法。该法是间接法的进一步改进, 涉及第三层过氧化物酶标记的过氧化物酶抗体。该抗体与第二层未标记抗体结合。因为过氧化物酶分子不是通过化学方法与IgG结合而是通过免疫结合, 故灵敏度高出100-1000倍。PAP法一抗的稀释倍数增高, 可减少非特异性的背景染色。
>>ABC法
ABC(avidin-biotin-complex)代表的是亲和素-生物素-过氧化物酶复合物。利用亲和素分别连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。但是此法注意内源性生物素活性的消除, 以减少非特异性的染色。
>>间接法
间接法涉及一个未标记的一抗(第一层，直接跟组织抗原反应)和一个标记的二抗(第二层, 与一抗反应)。因为二抗可跟一抗上多个不同的抗原位点结合, 放大信号, 从而提高了该法的灵敏度。当二抗标记上荧光染料, 如FITC、罗丹明、德克萨斯红等, 即是间接免疫荧光法。当二抗标记上酶, 如过氧化物酶、碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶, 即是间接免疫酶法。
>>SP法
SP(streptavidin-perosidase)法, 即链亲和素-过氧化物酶连结法, 是采用生物素标记的第二抗体与链亲和素连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞或组织中的抗原。链亲和素是一种金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质, 它能与各种动物的IgG的Fc段结合, 在免疫组化中可作为桥连抗体或标记抗体。最大的优点是不受种属的特异性限制。此法还具有染色时间短、灵敏度高、背景染色淡等优点, 分子量小, 易于穿透组织。
※ ABC法 VS SP法
ABC法的’三抗’是SABC复合物即链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物
SP法的’三抗’是过氧化物酶直接与链酶亲和素相连的, 没有通过生物素的中介连接
免疫组化常用染色方法
根据标记物的不同分为免疫荧光法、免疫酶标法和免疫胶体金技术。
| >>免疫荧光法 |
>>免疫酶标法 |
>>免疫胶体金法 |
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免疫荧光染色是最早出现的免疫组化的染色方法。基于抗原抗体的免疫反应, 结合抗原的带荧光标记的抗体在荧光显微镜下通过特殊波段的激发从而发出荧光, 以此定位结合抗原的位置。免疫荧光因其高灵敏性、特异性、简便性, 被广泛应用于医学分析和诊断。
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在免疫酶染色法中, 酶标记的抗体与组织或细胞内的特异性抗原相结合。加入酶显色底物后, 形成不可溶性物质, 通过显微镜
可观察定位。
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免疫胶体金法采用胶体金作为标记物, 这种特殊的金属离子呈胶体形式, 可快速稳定地结合蛋白质。此外, 胶体金几乎不影响天然蛋白质的生物活性。因此胶体金是一种理想的材料, 用于结合一抗、二抗或其他蛋白的IgG部位, 从而定位组织或培养细胞上的特定抗原。由于胶体金离子的大小和电子密度不同, 免疫胶体金法可适用于免疫电子显微镜或光学显微镜下单或多标记检测。
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