流式细胞术的荧光知识
一、荧光知识
荧光素按激发光波长来分，主要是激发波长为375 nm、405 nm、488 nm和633 nm 4类，其中，常用的是激发波长为488 nm和633 nm的荧光素，如FITC、PE、APC、PI等。
激发波长为488nm的荧光素
1) 异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）：FITC是应用最为广泛的一种荧光素，经激光激发后发出明亮的黄绿色荧光，最大发射波长为525 nm。FITC的荧光强度受PH影响较大，常随着PH的降低而减弱，因此，在使用FITC时需格外注意溶液的酸碱度。
2) Alexa Fluor 488：Alexa Fluor是美国分子探针公司开发的系列荧光染料，Alexa Fluor 488的发射光谱与FITC几乎一致，经激光激发后发出绿色荧光，最大发射波长为519 nm，但其荧光强度和稳定性要优于FITC。一般来说，Alexa Fluor 488在pH 4-10范围内能保持较好的光稳定性。
3) 藻红蛋白（phycoerythrin，PE）：PE是从红藻中分离纯化获得的一种常见染料，经激光激发后发出橙黄色荧光，最大发射波长为575 nm。PE具有吸光性能好和光量子产率高的特点，可用于标记表达水平较低的蛋白。在流式细胞术检测中，PE标记的抗体适用于所有配备488 nm氩离子激光器的流式细胞仪。
4) PE-Cy5：PE-Cy5是一种复合染料，属于藻红蛋白偶联物，在此类复合染料中，激发能量可从PE传递到Cy5上，最大发射波长为667 nm。由于PE-Cy5与FITC、PE在光谱上重叠范围较少，荧光干扰少，因此实验中常将PE-Cy5与FITC、PE搭配使用。需注意，PE-Cy5不适合与APC搭配使用，两者荧光重叠大。
5)PE-Cy5.5：PE-Cy5.5也是一种复合染料，能量从PE传递到Cy5.5上，最大发射波长为694 nm。同PE-Cy5不一样，PE-Cy5.5与FITC、PE、APC间荧光干扰小，可搭配使用，且其荧光强度要优于PE-Cy5。
6) PE-Cy7：复合染料，最大发射波长为785 nm。PE-Cy7与FITC无光谱重叠，与APC重叠也较少，因此其可与FITC、PE、APC搭配使用。在实验中需要注意，PE-Cy7的光淬灭性很强，需要绝对避光环境。
7) PerCP-Cy5.5：复合染料，最大发射波长为695 nm。与PerCP相反，PerCP的光量子产率较低，适用于表达水平较高物质的检测，PerCP-Cy5.5光量子产率高，可用于表达水平较低物质的检测。在双激光管仪器上与APC共同检测时，需要做补偿调节，但比PerCP补偿少。
8) PI/7-AAD：碘化丙啶（propidium iodide，PI）和7-AAD（7-amino-actinomycin D）的最大发射波长分别为617 nm和647 nm，是常见的荧光染料，常用于细胞凋亡检测，可用于鉴别死、活细胞。在大部分流式细胞仪上，PI在FL2或FL3通道检测，7-AAD在FL3通道检测。7-AAD同PI 有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。
激发波长为633nm的荧光素
1) 别藻青蛋白（allophycocyanin，APC）：APC最大发射波长为660 nm，其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪，检测通道一般是FL4通道。FITC、PE和APC搭配是经典3色搭配。
2) Cy5：Cy5属于小分子染料，其最大发射波长为670 nm，其标记的抗体适用于所有配备633 nm氩离子激光器的流式细胞仪，检测通道一般是FL4通道。除流式细胞术外，Cy5同样适用于传统的荧光显微镜技术。需注意的是，Cy5与单核细胞和粒细胞的非特异性结合多，实验结果容易出现假阳性。
3) Alexa Fluor 647：Alexa Fluor 647是一种明亮的红色荧光染料，其最大发射波长为668 nm，一般在流式细胞仪的FL4通道检测。Alexa Fluor 647具有荧光量子产率高、光稳定性好、适宜的pH范围广和不易淬灭等特点，是APC和Cy5的优质替代品。
二、荧光素的选择
在流式细胞术实验，各种荧光素标记的抗体是必不可少的。那么荧光素该如何选择呢，通常会参考以下5个方面：
1. 流式细胞仪配置：仪器需满足激光管可激发相应的荧光素且可同时检测所需的荧光。附常见荧光素的激发波长和发射波长：
2. 染料的亮度与抗原表达量相匹配：低表达抗原，推荐使用亮荧光染料；高表达抗原，推荐使用弱荧光染料。
3. 荧光染料重叠最小化：尽量选择光谱重叠小的荧光素，如FITC/PE-Cy7；选择不同激光激发的荧光素，如FITC/APC，PE/APC。
光谱重叠严重的荧光素同时检测会导致荧光溢漏，需调节补偿。
4. 避免复合染料联合使用带来的假阳性：常见的复合染料有PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7等，复合染料的信号衰退会降低APC或PE的灵敏度。如果出现信号衰退，则：
● 减少样本暴露于光、高温或固定剂；
● 选择染料时考虑：复合染料的信号衰退会降低APC或PE的灵敏度，避免染料和其衍生物在同一细胞上标记。选择更稳定的tandem-dye（PerCp-Cy5.5）；
● 如果样本需固定，选择稳定、可有效阻止复合染料信号衰退的固定剂多聚甲醛：冰上固定10min，离心除去多聚甲醛，将样品重悬于PBS中。
5. 尽量使用红色激光激发自发荧光高的样本：每种细胞群都有不同水平的自发荧光。所有的荧光通道均可观察到自发荧光，但自发荧光强度在波长较长时迅速降低。对自发荧光较强的细胞，选择红光激发，发射波长长的荧光素（如APC）可得到较好的S/N比值；对自发荧光比较弱的细胞，发射波长长的荧光素对S/N提高没有明显的改善，可选用FITC。
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