产品简介：

pGEX载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽S-转移酶融合，因此可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。GSTs是一类以谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）作为底物，通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST对底物的亲和力是亚毫摩尔级的，因此谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST及其融合蛋白的纯化效率很高。可以用含游离谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合GST融合蛋白。树脂用3mol/L NaCl的缓冲液再生。谷胱甘肽琼脂糖对GST融合蛋白的结合能力很强（每毫升柱床体积的树脂能结合8毫克融合蛋白）。

特性: 粒度：45-165µm 流速：75cm/h           工作PH：4-10 耐压：0.3Mpa载量：＞10mg 谷胱甘肽 S-转移酶

使用说明：

谷胱甘肽树脂的处理:

1. 轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆。

2. 取部分匀浆放入15mL聚丙烯管（每100mL 细菌培养物大约需要2mL 匀浆）。

3. 4℃ 500 g离心5分钟，小心去掉上清。

4. 在树脂中加入10倍柱床体积预冷的PBS，颠倒数次混匀，4℃ 500 g离心5分钟，小心去掉上清。

5. 每毫升树脂加入1毫升冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用。制备细胞抽提物：

6. 每100毫升培养物的细胞沉淀重悬于4mL PBS缓冲液中。

7. 加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL,冰上放置30分钟。

8. 用针筒将10mL 浓度为0.2%的TritonX-100 强行注入黏稠的细胞裂解物中，剧烈振动数次混匀。加入DNase和RNase至终浓度5ug/mL, 4℃振动温育10分钟，4℃ 3000 g离心30分钟，去除不溶性细胞碎片，上清转移到一只新管中，加入DTT至终浓度1mmol/L。纯化融合蛋白：

9. 细胞裂解物与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混和，每100毫升细菌培养物加2mL树脂，于室温轻摇30min。

10. 混合物于4℃以500 g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1. 沉淀中加入10倍柱床体积的冷的PBS，颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白。

2. 4℃以500 g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

3. 重复步骤11和12两次。

4. 结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱液洗脱，也可用凝血酶、肠激酶或Xa 因子切割，释放靶蛋白。

用谷胱甘肽洗脱融合蛋白：

5. 沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min，洗脱树脂上结合的蛋白。

6. 4℃以500 g离心5分钟，上清（含洗脱的融合蛋白）移至新管中。

7. 重复步骤a和b两次，合并3次上清。蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶蛋白：

8. 在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶、肠激酶或Xa 因子（根据融合蛋白中的位点选择），每mL树脂加入50单位溶于1mLPBS的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀，室温下振荡2—16小时。用小规模实验确定精确时间。

9. 4℃以500 g离心5分钟，上清小心移至新管中。（GST仍结合在树脂上，而靶蛋白在上清中，蛋白酶也在上清中，仍需要分离）

10. 10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析每一步样品的蛋白质组成。试剂配制：谷胱甘肽洗脱缓冲液：10mmol/L还原型谷胱甘肽，50mmol/L Tris-Cl (pH8.0)

 备注：产品信息可能会有优化升级。请以实际标签信息为准。

明胶-琼脂糖凝胶 4FF 是采用溴化氰法将明胶耦合到琼脂糖凝胶 4FF 基质上的一种亲和层析填 料。明胶是一种高分子糖蛋白，在多种细胞的表面和许多细胞外液（包括血浆）中都发现了明胶的 存在，它可以特异性的结合纤维连接蛋白。明胶琼脂糖凝胶 4FF 是专为纯化或除去纤维连接蛋白的 一种亲和层析填料。

1 技术指标

2 使用方法

2.1 准备凝胶

（1）让凝胶和所有的试剂达到工作时的温度。

（2）配制初始缓冲液（平衡液）和洗脱缓冲液。

（3）明胶琼脂糖凝胶 4FF 是保存在 20%的乙醇溶液中，取适量凝胶，清洗掉 20%的乙醇，抽 干。用缓冲液（按凝胶：缓冲液=3：1 的比例）配成匀浆。

2.2 装柱

（1）将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位（液面略高于滤膜），务必使底端 无气泡。

（2）用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡。打开柱子出液口， 使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。

（3）打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的 1.33 倍的流速流过，使柱床稳定。用 2~3 倍柱体 积的缓冲液平衡柱子。

2.3 平衡 让平衡缓冲液以一定流速流过柱子，到流出液电导和 pH 不变。

2.4 上样 （1）样品用平衡液配制，常用磷酸盐缓冲液或 Tris-HCl 缓冲液，浑浊的样品要离心和过滤后 上样。

（2）一般情况是让目标产品结合在柱子上，用平衡液洗去杂质，再选择一种洗脱液洗下目标 产品。

2.4 洗脱 明胶-琼脂糖凝胶 4FF 可以采用不同的方式洗脱纤维连接蛋白：

（1）使用含有溴盐的缓冲液，例如溴化钠或溴化钾，并在低于平衡缓冲液 pH 值的条件下洗脱。 一种推荐的洗脱缓冲液是：0.05 M 的醋酸钠，pH 值 5.0，含 1.0 M 的溴化钠或溴化钾。

（2）可以在平衡缓冲液中加入 8 M 的脲，来洗脱吸附在凝胶上的纤维连接蛋白。

（3）纤维连接蛋白还可以通过在平衡缓冲液中添加精氨酸来进行洗脱。

2.6 再生 根据样品的性质，明胶琼脂糖凝胶 4FF 可以再生，以达到重复使用的目的。可以采用 2-3 柱体 积的高 pH 值（0.1 M 的 Tris – HCl，0.5 M NaCl，pH 值 8.5）的缓冲液和低 pH 值（0.1 M NaAC，0.5 M NaCl，pH 值 4.5）的缓冲液交替清洗凝胶。一个周期重复 3 次，然后用 3-5 倍柱体积的平衡缓冲 液平衡，即可进行下次试验。如果在纯化过程中使用了洗涤剂或变性剂（如 8 M 尿素），那么这些 洗涤剂也可以用于洗脱缓冲液中。 2.7 清洗 在一些应用中，像变性的蛋白质或脂类这样的样品，在再生过程没有被洗脱下来，可以通过加 入一些洗涤剂，例如：0.1％的 Triton X-100 ，在 37°C 的条件下洗一会。立即用至少 5 倍柱体积的 结合缓冲重新平衡。 2.8 储存 明胶-琼脂糖凝胶 4FF 应储存在 4-8℃，20%的乙醇溶液中。 特别注意： 上样之前，样品必须去除色素，否则色素会被吸附到填料上，影响填料的正常使用。

  备注：产品信息可能会有优化升级。请以实际标签信息为准。