StressMarq——Alpha 突触核蛋白产品推荐（3）

StressMarq——Alpha 突触核蛋白产品推荐（3）

Alpha 突触核蛋白A53T 突变型PFF

Alpha 突触核蛋白 A53T PFFs (目录号 SPR-326) 在培养的原代大鼠神经元中诱导丝氨酸 129 磷酸化

培养基中 1 µg/ml 超声处理的 StressMarq’s Alpha 突触核蛋白 A53T 突变 PFF（目录号 SPR-326）可诱导原代大鼠神经元中 Ser129 磷酸化。

来源: Associate Professor Rehana Leak,Duquesne University, USA

Alpha 突触核蛋白寡聚体
与不溶性原纤维相比，寡聚体是小的（25-30 nm）球状可溶结构。它们是与帕金森病相关的有毒聚集体，在结构上与原纤维不同。 负染色（铀酰酸）的电子显微镜图显示了Alpha 突触核蛋白的寡聚体结构，左侧为用多巴胺处理的alpha 突触核蛋白寡聚体 (目录号 SPR-466)，中间为EGCG处理的 (目录号 SPR-469) ，右侧为动态学稳定的寡聚体 (目录号 SPR-484).
来源: EM performed at U. of British Columbia	来源: EM performed at U. of British Columbia	来源: EM performed at University of Toront

Alpha 突触核蛋白毒性
100 µg/ml 的各种 α-突触核蛋白对原代小鼠皮质神经元的毒性测试，一式四份： 孵育 24 小时后进行 MTT 测定（左）和 LDH 释放测定（右）。
	寡聚体诱发的神经元毒性明显高于原纤维

来源: performed at QPS Austria GmbH

ATTO 594 标记的原纤维也有聚集活

ATTO594 标记的 (目录号 SPR-322-A594) 人 1型 Alpha 突触核蛋白PFF

ATTO 594 标记不会显著影响目录号 SPR-322 的聚集能力

ATTO 594 PFF 诱发人神经元中的病理现象

神经元培养试剂盒: 预分化的混合神经元 (血细胞iPSC;) 每孔4000个细胞。

细胞染色: 上: pSer129 α –syn 染色 (Alpha 突触核蛋白抗体, StressMarq 目录号 SMC-600), 绿色 中: ATTO 594 染色, 红色 下: 以上两者复合图, 外加肌动蛋白 (粉色) 和DNA (蓝色) 染色. 来源: ICC human iPSCs; CellState Biosciences, USA

与 Cellectricon (瑞典) 的合作项目

ATTO 标记的 PFF（目录号 SPR-322-A594）被引入微流控系统的第 1 室

荧光标记的 α 突触核蛋白原纤维 (目录号 SPR-322-A594) 被第 1 室的神经元摄取，并转运到第 2 室的细胞体中，诱导 α 突触核蛋白磷酸化。

ATTO-594 PFF 诱导大鼠肠神经元中Alpha 突触核蛋白聚集

Northeastern大学的研究人员使用 StressMarq 的 ATTO 594 标记的 Alpha 突触核蛋白 PFF（目录号 SPR-322-A594）来研究不同剂量下大鼠肠神经元对荧光标记的 PFF的吸收和保留。将前体原纤维 PD 模型应用于丁酸盐和脂多糖的共同给药组，以模拟局部肠道微生物组的影响。 ● 大鼠肠道和皮质神经元中 PFF 的摄取和保留具有显著的剂量依赖性 ● 加入了PFF 的肠神经系统 (ENS) 培养物的生长锥形态发生变化 ●  ENS 克服了 PFF 剂量以保持稳定的活性

(A) 理论上的前体原纤维 (PFF) 毒性进展的图示，从 PFF 的引入到神经元的摄取以及内源 α-突触核蛋白 (a-Syn) 的进一步聚集。 (B) 实验设计的时间表。 在整个实验期间，每 2-3 天喂养一次培养物。 (C) 为实验分离出来的神经元群（皮质和肠）的代表性图像，方框圈出的对应的解剖位置。

来源: Bindas et al. https://doi.org/10.1038/s41598-022-26543-x

动态学稳定的Alpha 突触核蛋白寡聚体
动态学稳定的alpha-突触核蛋白寡聚体的电镜图 (目录号 SPR-484)	(B)和(C)分别是冻融一次后的和37℃孵育两周后的尺寸排阻色谱(SEC)。在峰值处，90%SPR-484在冻融后37℃下孵育两周仍然稳定于寡聚体状态。
动态学稳定的 Alpha 突触核蛋白寡聚体 (目录号 SPR-484) 稳定于球状的寡聚体结构。
用对照 PBS 缓冲液处理后 11 天的原代大鼠多巴胺能神经元（左）和用 10 µg/mL 目录号 SPR-484 处理 11 天后的原代大鼠多巴胺能神经元（右）。细胞核呈蓝色 (Hoechst)，多巴胺能神经元呈红色 (MAP2)，病理现象呈绿色 (α-syn pSer129)。白色箭头指出的是 MAP2 阳性神经元中有明显 pSer129 病理现象的几个区域。
动态学稳定的Alpha突触核蛋白寡聚体 (目录号 SPR-484) 诱发原代大鼠多巴胺能神经元中的pSer129 病理现象

使用α 突触核蛋白单体、PFF 和 动态学稳定的寡聚体 开发的一种新型检测方法

爱丁堡大学的研究人员与 StressMarq Biosciences 合作，使用 α 突触核蛋白单体（目录# SPR-321）、PFF（目录# SPR-322）和动态学稳定的寡聚体（目录# SPR-484）开发了一种定量和表征聚集体的测定方法。这种新技术称为单分子双色聚集体下拉 ( STAPull )，可能是早期诊断中很有前景的工具，因为它能够检测皮摩尔级的寡聚体 α 突触核蛋白，与单色检测相比，灵敏度提高三倍。 ● 当两种正交标记的检测抗体靶向相同的表位时检测到寡聚体，从而导致双色共定位。 α突触核蛋白单体产生单色信号。 ● 这种新颖的方法可检测到动态学稳定的寡聚体（目录# SPR-484），这些寡聚体最有可能存在于帕金森病的最早阶段。

STAPull检测ThT阴性α- syn 寡聚体。 A) StressMarq 的人源重组 α-syn 的代表性SiMPull图像，其呈单体、动态学稳定的寡聚体或前体原纤维形式，如图所示。ThT 检测（顶部）或STAPull双色重合（底部）呈现的是相同的视野，插图是方框区域被放大。全视野比例尺为5 μm，插图为2 μm。 B) ThT 斑点平均数的量化，C) (A) 中表示的数据集的每平方微米STAPull重合事件。 参考文献： Saleeb ，R. 等人。 DOI： 10.1126/sciadv.adi7359

Tau-352 (胚胎 0N3R) & Alpha 突触核蛋白共聚集体原纤维
Tau-352 和 Alpha 突触核蛋白共聚体原纤维 （目录号 SPR-494）的电镜	胚胎 Tau-352 0N3R & Alpha 突触核蛋白共聚集体原纤维的体外聚集硫磺素T检测
来源: University of Toronto, Canada	来源: StressMarq Lab; internal results
StressMarq 的共聚体原纤维是将单体共孵育在一起之后形成的原纤维，所以该原纤维在单个原纤维中同时含有 Tau 和 Alpha 突触核蛋白。 Tau 0N3R 和 Alpha 突触核蛋白共聚集体原纤维 (目录号 SPR-494) 在72小时内既可以聚集 Alpha 突触核蛋白单体，也可以聚集Alpha 突触核蛋白和 Tau 0N3R 混合的单体。

Tau-441 (2N4R) & Alpha 突触核蛋白共聚集体原纤维
Tau-441 和 Alpha 突触核蛋白共聚集体原纤维 (目录号 SPR-495) 的电镜图	Tau 2N4R & Alpha 突触核蛋白共聚集体原纤维的体外聚集硫磺素T检
来源: University of Toronto, Canada	来源: StressMarq Lab; internal results
StressMarq 的共聚体原纤维是将单体共孵育在一起之后形成的原纤维，所以该原纤维在单个原纤维中同时含有 Tau 和 Alpha 突触核蛋白。 Tau 2N4R 和 Alpha 突触核蛋白共聚集体原纤维 (目录号 SPR-495) 在72小时内既可以聚集 Alpha 突触核蛋白单体，也可以聚集Alpha 突触核蛋白和 Tau 2N4R 混合的单体。

Tau & Alpha 突触核蛋白共聚集体原纤维的免疫-TEM

原纤维被吸附到碳涂层铜网格上。 6nm（asyn）和 12nm（tau）信号同时出现在共聚集体原纤维样品的同一原纤维链中(目录号 SPR-494, SPR-495)，并且在对照 α-突触核蛋白或 tau 原纤维中未观察到抗体交叉反应。

网格用含1% BSA 和 0.1% Tween-20 的 PBS 封闭，洗涤，然后依次在封闭缓冲液中用 20 µg/mL 的一抗孵育，洗涤，再在封闭缓冲液中用 20 µg/mL 的二抗孵育，洗涤并用2% 乙酸双氧铀作为负染色。 一抗: 小鼠抗人asyn单克隆抗体（StressMarq SMC-532）和兔抗人tau多克隆抗体（StressMarq SPC-802）;  二抗: 6nm 胶体金标记的山羊抗小鼠抗体 (Jackson ImmunoResearch 115-195-146) 和 12nm 胶体金标记的山羊抗兔抗体 (Jackson ImmunoResearch 115-195-146)。

StressMarq Alpha 突触核蛋白发表文献

人 Alpha 突触核蛋白前体原纤维 (1型)，目录号 SPR-322

Deciphering the role of hsp110 chaperones in diseases of protein misfolding. Yakubu, U. M. (2021) PhD Thesis, University of Texas.

2. Suppression of aggregate and amyloid formation by a novel intrinsically disordered region in metazoan Hsp110 chaperones. Yakubu, U.M. Morano, K.A. (2021) J Biol Chem Jan-Jun 2021;296:100567.

3. Design, Synthesis and Chemically Engineered Graphene Quantum Dot Applications: Contrast Agent for MR Imaging and Targeted Therapeutics on Parkinson’s Treatment. Poonkuzhali, K. et al. (2022) SSRN 4056733.

4. Rational Generation of Monoclonal Antibodies Selective for Pathogenic Forms of Alpha-Synuclein. Gibbs, E. et al. (2022) Biomedicines 10,2168. 

5. LRP1 is a neuronal receptor for α-synuclein uptake and spread. Chen, K. et al. (2022) Molecular Neurodegeneration 17(1):57. 

6. Granulovacuolar degeneration bodies are independently induced by tau and α-synuclein pathology. Jorge-Oliva, M. et al. (2022) Alzheimer’s Research and Therapy (14)187.

7. Disrupting the α-synuclein- ESCRT interaction with a peptide inhibitor mitigates neurodegeneration in preclinical models of Parkinson’s disease. Nim, S. et al. (2023) Nat Commun 14, 2150.

8. a-Synuclein-dependent increases in PIP5K1γ drive inositol signaling to promote neurotoxicity. Horvath, J. D. et al. (2023) Cell Reports 42, 113244 (Also cited catalog# SPR-480 and SPR-487).

9. Immunization Effects of a Novel α-Synuclein-Based Peptide Epitope Vaccine in Parkinson’s Disease-Associated Pathology. Park, J.S. et al. (2023) Vaccines 11:1820.

小鼠 Alpha 突触核蛋白前体原纤维 (1型)，目录号 SPR-324

The SUMO conjugase Ubc9 protects Dopaminergic cells from cytotoxicity and enhances the stability of α-synuclein in Parkinson’s disease models. Verma, D.K. et al. (2020) eNeuro 0134-20.2020.

Alpha-Synuclein Preformed Fibrils Induce Cellular Senescence in Parkinson’s Disease Models. Verma, D.K. et al. (2021) Cells 10, 1694.

Heat Shock Protein 70 as a Sex-Skewed Regulator of α-Synucleinopathy.Bhatia, T. N. et al.  (2021) Neurotherapeutics Oct;18(4):2541-2564.

Domain-Independent Inhibition of CBP/p300 Attenuates α-Synuclein Aggregation. Hlushchuk, I. et al. (2021) ACS Chemical Neuroscience Jul 7;12(13):2273-2279.

A Novel NOX Inhibitor Treatment Attenuates Parkinson’s Disease-Related Pathology in 小鼠 Models. Ghosh, A. A. et al. (2022) Int J Mol Sci 23, 4262.

Cell Culture Media, Unlike the Presence of Insulin, Affect α-Synuclein Aggregation in Dopaminergic Neurons. Hlushchuk, I. et al. (2022) Biomolecules 12, 563.

Targeted degradation of ⍺-synuclein aggregates in Parkinson’s disease using the AUTOTAC technology. Lee, J. et al. (2023) Mol Neurodegeneration 18, 41.

A Novel NOX Inhibitor Alleviates Parkinson’s Disease Pathology in PFF-Injected Mice. Ofori, K. et al. (2023) preprint.

Genetic and pharmacological reduction of CDK14 mitigates α-synuclein pathology in human neurons and in rodent models of Parkinson’s disease. Parmasad, J.L., et al. (2023) bioRxin preprint.

Identifying Novel Targets and Potential Therapeutics for Parkinson’s Disease. Gosh, A.A et al. (2023) PHD Thesis  Delaware State University.

11. Fluorescent Peptide-based Probe for the Detection of Alpha-synuclein Aggregates in the Gut. Sim, R. (2023) bioRxin preprint.

人 Alpha 突触核蛋白前体原纤维: ATTO-594 (1型)，目录号 SPR-322-A594

Aggregation of alpha-synuclein in enteric neurons does not impact function in vitro. Bindas, A.J. et al. (2022) Sci Rep 12, 22211.

人 Alpha 突触核蛋白A53T 突变型前体原纤维 (1型)，目录号 SPR-326

Environmental enrichment reduced pathological α-Synuclein accumulation by restoring LAMP1 via Reelin in early stage of Parkinson’s disease. Cho, E. (2021) PhD Thesis, Yonsei University.

Reelin Alleviates Mesenchymal Stem Cell Senescence and Reduces Pathological α-Synuclein Expression in an In Vitro Model of Parkinson’s Disease. Cho, E. (2021) Genes 12, 1066.

Reelin protects against pathological alpha-synuclein accumulation and dopaminergic neurodegeneration after environmental enrichment in Parkinson’s disease. Cho, E. et al. (2022) Neurobiology of Disease 175:105898.

人 Alpha 突触核蛋白前体原纤维 (2型), 目录号 SPR-317

Directed Evolution of Antibodies Against Complex Targets. Desai, A. (2021) PhD Thesis, University of Michigan.

Observation of α-Synuclein Preformed Fibrils Interacting with SH-SY5Y Neuroblastoma Cell Membranes Using Scanning Ion Conductance Microscopy. Feng, C. et al. (2022) ACS Chemical Neuroscience. DOI: 101021/acschemneuro.2c00478.

Flow cytometric isolation of drug-like conformational antibodies specific for amyloid fibrils. Desai, A. et al.(2023) bioRxin preprint. (Also cited catalog# SPR-332, SPR-324 & SPR-484)

人 Alpha 突触核蛋白 A53T 突变型蛋白单体 (Type 1), 目录号 SPR-325

Mutant a-synuclein propagates via the lymphatic system of the brain in the monomeric state. Fujita, K. et al. (2023) Cell Reports, 112962.

人 Alpha 突触核蛋白单体 (1型), 目录号 SPR-321

Deciphering the role of hsp110 chaperones in diseases of protein misfolding. Yakubu, U. M. (2021) PhD Thesis, University of Texas.

Suppression of aggregate and amyloid formation by a novel intrinsically disordered region in metazoan Hsp110 chaperones. Yakubu, U.M., Morano, K.A. (2021) J Biol Chem Jan-Jun 2021;296:100567.

人 Alpha 突触核蛋白寡聚体 (动态学稳定的), 目录号 SPR-484

LRP1 is a neuronal receptor for α-synuclein uptake and spread. Chen, K. et al. (2022) Molecular Neurodegeneration 17(1):57.

其他相关产品：

StressMarq的 Alpha 突触核蛋白抗体

总 结

● 多种α突触核蛋白聚集体可诱发疾病

● StressMarq 研发了一系列 α 突触核蛋白，包括： 两种类型的人源 α 突触核蛋白 PFF； A53T 突变型原纤维； N-乙酰化原纤维；小鼠和大鼠 PFF；未成熟的原纤维；动态学稳定的寡聚体；盐酸多巴胺稳定的寡聚体、EGCG 稳定寡聚体、tau 和 α 突触核蛋白共聚集体原纤维

● 一些 PFF 由相同的起始单体原料制成，在 EM 下看起来形态相似，但它们是在不同的条件下聚集生产的PFF

● 不同的α突触核蛋白形式具有明显不同的神经元和生理活性

● 单体、寡聚体、原纤维和纤丝α突触核蛋白都与帕金森病有关.

● StressMarq 提供各种工具用于突触核蛋白病研究

更多详情请联系Stressmarq中国代理商——上海金畔生物

Stressmarq——Alpha突触核蛋白&神经退行性疾病

Alpha突触核蛋白科研背景

● Alpha突触核蛋白约 15kDa, 140个氨基酸

● StressMarq在E. coli中过表达人源基因然后将蛋白从细胞质基质中纯化出来

● 未折叠的alpha突触核蛋白单体在12% SDS-PAGE上为~15 kDa的条带

纯化后的 Alpha 突触核蛋白单体的 SDS-PAGE 分析, 纯度 >95%
12% SDS-PAGE gel, Coomassie stained	12% Native-PAGE gel, Coomassie stained

突触核蛋白在神经退行性疾病中的作用

Alpha突触核蛋白被表明可以聚集形成各种类型的寡聚体和原纤维形式，它们像朊病毒一样 “复制”，将 Alpha突触核蛋白单体按照错误折叠的样本蛋白折叠成同样的3D结构。研究表明通过转移这些错误折叠的聚集体，疾病由一个神经元扩散到另一个神经元，例如， 突触错误折叠的Alpha突触核蛋白聚集体是有毒的并且可以使神经元进入细胞凋亡。

● 突触核蛋白病指的是一类神经退行性疾病，包括帕金森 (PD)、 路易体痴呆 (DLB)、弥漫性路易体病 (DLBD)和多系统萎缩 (MSA), 这些都是由错误折叠的Alpha突触核蛋白引起的。

● 已经建立的帕金森疾病模型：

1、原代啮齿动物神经元

2、iPSC 诱导的人神经元

3、动物模型 (小鼠, 大鼠和猴)

Alpha 突触核蛋白结构

来源: Ottolini et al. https://doi.org/10.1515/hsz-2016-0201

Alpha 突触核蛋白病理学

来源: Jensforian; https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Lewy_neurites_alpha_synuclein.jpg

Alpha 突触核蛋白聚集机制

来源: Vaikath et al., https://doi.org/10.1111/jnc.14713

Alpha 突触核蛋白毒性机制

来源: Wong & Krainc https://doi.org/10.1038/nm.4269

帕金森病科研背景

● 帕金森病是第二大常见的神经退行性疾病，症状包括：

1、运动障碍包括自主神经功能失调

2、神经精神病学的变化 (认知, 想法, 睡眠和行为改变)

3、感觉(尤其是嗅觉)的影响

● 帕金森病的生化机理是神经元中不溶“路易体”的形成，主要成分是聚集的Alpha 突触核蛋白

● Alpha 突触核蛋白单体是高度易溶的小分子蛋白，没有内部结构，在大脑中广泛存在，主要集中在神经元突触前体末端

● Alpha 突触核蛋白参与信号传导的突触小泡释放, 包括多巴胺（调控运动）

● 可溶的错误折叠的alpha 突触核蛋白具有神经毒性并且可以类朊病毒样扩散疾病

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