·该高保真酶为 Spy Cas9 核酸酶的突体，含有四个突变位点（N497A/R661A/Q695A/Q926A），可减少脱靶切割

·是直接导入 Cas9/sgRNA 复合物进行基因编辑的理想选择

·与 EnGen sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes (NEB #E3322S) 和 EnGen 突变检测试剂盒 (NEB #E3321S) 兼容

 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶为EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶的高保真突变体，基因克隆自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes），含有 4 个突变位点 (N497A/R661A/Q695A/Q926A)，可显著减少 DNA 的非特异性切割。Spy Cas9 是一种由 RNA 引导的核酸内切酶，可在靶向位点特异切割双链 DNA。单链向导 RNA (sgRNA) 将 Cas9 靶向 5′-NGG-3′ PAM 序列（protospacer adjacent motif）上游的区域，并在 PAM 上游的第 3 个碱基外进行双链切割 ⁽¹⁾。EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶在其蛋白质的 N 端和 C 端带有 SV40 （Simian virus 40）T 抗原核定位序列 (NLS)。

图 1：sgRNA 引导 S. pyogenes Cas9 核酸酶切割靶标 DNA 示意图

上图中，S. pyogenes Cas9 (Spy Cas9) 蛋白以米色显示，sgRNA 以蓝色显示，DNA 以灰色、绿色和红色显示。DNA 靶标以及前间隔序列以绿色显示，图中 R-loop 区域展示了靶标序列与向导RNA互补配对。Cas9 与 DNA 结合所需的 PAM 序列（protospacer adjacent motif）以红色显示，以黑色三角标注 DNA 的切割位置。橙色标签标注了 Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶⁽²⁾ 中突变氨基酸的相对位置，这些突变氨基酸与靶标 DNA 的结合位点位于 RNP-DNA 复合物中 PAM 的远端区域。

图 2：EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶针对于三个不同靶基因的编辑效率和脱靶率

通过二代测序确定 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶的保真度。首先在 Nucleofector 核转染系统中预制 RNP 复合物，Cas9 浓度为 2 μM，sgRNA 浓度为 4 μM；然后将 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶（野生型）和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶的 RNPs 复合物电转入 1×10⁵ HEK293 细胞中，靶向位点为 EMX1 (A)、FANCF (B) 和 ZSCAN2 (C) ⁽²⁾。电穿孔后 48–72 小时，从电穿孔细胞中提取基因组 DNA，并对靶基因和之前用 GUIDESeq ⁽²⁾ 鉴定的 7 种脱靶位点进行 PCR 扩增 DNA。使用 NEBNext^® Ultra™ II DNA 文库制备试剂盒和 NEBNext 多样本接头引物试剂盒将扩增产物转化为 Illumina^® 测序文库。使用 CRISPResso 2 ⁽³⁾ 分析测序数据。结果分别展示了 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶（野生型）、EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶和非靶向对照对靶向位点和 7 个脱靶位点（1–4 个碱基替换）切割比例。图中列出了每个靶基因序列，其中 PAM 以金色框表示，与脱靶相关的碱基替换位点以绿色框表示，如果碱基替换发生在 PAM 序列的可变区，则以灰色框表示。该测试设置 3 个平行试验。误差线表示标准差.

图 3：体外实验中显示，EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对 DNA 靶标中的碱基替换更加敏感

 比较使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶时，向导 RNA 序列与靶标 DNA 序列结合的错配容忍度。首先对完全匹配的靶序列进行改造，使其包含 1-2 个碱基替换、插入、缺失，或者相对于标准 PAM 序列包含 1 个碱基替换，然后分别使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对其进行切割，37℃ 孵育 1 小时。以切割后的 DNA 为模板 PCR 扩增 5 个循环，添加测序接头，再进行 Illumina 测序。每个序列的丰度除以未被 Cas9 切割的 DNA 池序列的丰度，该比例以 log₂ 标度绘制。该值 ≥0.0 表示序列未被 Cas9 切割，＜0.0 表示被 Cas9 切割。将上述 log₂ 值以热点图形式绘制，横轴对应碱基替换的位置和类型，蓝点高度对应 log₂ 值。

图 4：体外实验中显示，EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对 DNA 靶标中的碱基插入更加敏感

比较使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶时，向导 RNA 序列与靶标 DNA 序列结合的错配容忍度。首先对完全匹配的靶序列进行改造，使其包含 1-2 个碱基替换、插入、缺失，或者相对于标准 PAM 序列包含 1 个碱基替换，然后分别使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对其进行切割，37℃ 孵育 1 小时。以切割后的 DNA 为模板 PCR 扩增 5 个循环，添加测序接头，再进行 Illumina 测序。每个序列的丰度除以未被 Cas9 切割的 DNA 池序列的丰度，该比例以 log₂ 标度绘制。该值 ≥0.0 表示序列未被 Cas9 切割，＜0.0 表示被 Cas9 切割。结果图中，X 轴为碱基插入位置，Y 轴为 log₂ 值。对于单碱基差异序列，每个位置的插入碱基类型用彩色圆点表示。

 图 5：体外实验中显示，EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对 DNA 靶标中的碱基缺失更加敏感

 比较使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶时，向导 RNA 序列与靶标 DNA 序列结合的错配容忍度。首先对完全匹配的靶序列进行改造，使其包含 1-2 个碱基替换、插入、缺失，或者相对于标准 PAM 序列包含 1 个碱基替换，然后分别使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对其进行切割，37℃ 孵育 1 小时。以切割后的 DNA 为模板 PCR 扩增 5 个循环，添加测序接头，再进行 Illumina 测序。每个序列的丰度除以未被 Cas9 切割的 DNA 池序列的丰度，该比例以 log₂ 标度绘制。该值 ≥0.0 表示序列未被 Cas9 切割，＜0.0 表示被 Cas9 切割。结果图中，X 轴为碱基插入位置，Y 轴为 log₂ 值。对于单碱基差异序列，每个位置的缺失碱基类型用彩色圆点表示。