如何避免活细胞成像中的光漂白

●如何避免活细胞成像中的光漂白

光漂白，即光照条件下导致的荧光基团降解，其在活细胞成像中是一个非常严重的问题。在活细胞成像中使用高强度激发光可降低荧光基团发射荧光强度，甚至使其完全发射不出荧光。不过，这个问题是可以解决的。目前，在不影响细胞活性的前提下，科学家发现了几种可以保护荧光蛋白和荧光染料所发的荧光不发生衰减并能保持荧光信号强度的方法。

●怎样减少荧光漂白现象呢？

在进行活细胞成像时，可以采取以下几种方式减少光漂白现象的发生。GE医疗集团，细胞分析-基因组学研究领域产品支持和应用领导者Leanna Ferrand给出了如下几个建议：

1、使用与荧光显微镜的激发波长和发射波长相匹配的荧光染料和荧光蛋白进行细胞成像；

2、尽可能降低激发光的强度，减少曝光时间；

3、避免长时间将样品暴露在“无用”的光照条件下，例如在没有收集数据时在镜下长时间观察等；

4、当设计实验时，要仔细考虑所有的实验参数，收集足够多的信息来回答研究的问题即可，不要浪费时间在其他因素上。你考虑的参数包括整个实验的进行时间、实验进行期间的拍照频率、每次拍照使用的荧光通道数量、Z堆栈高度等；

注意，如果研究者拍照时间越长，那么考虑上述四个参数应该越严格，这样才能确保在实验中观察到正确的细胞活动，而不是荧光漂白或者光毒性现象。

●Oxyrase公司的销售市场经理Lisa Stewart同时也建议：

1、当进行观察时，使用中性密度滤光片来减少过多的曝光；

2、尽量选择对光不敏感的染料进行染色。

●使用减少光漂白的试剂

目前，市场上有一些公司可以提供专门用于活细胞成像实验中增强活细胞成像研究的试剂，比如Vector Laboratories公司的VectaCellTM Trolox 抗荧光淬灭剂。Vector Laboratories市场总监Melissa Rebar博士指出，抗荧光淬灭剂通常用于固定样品的成像。由于普通的抗荧光淬灭剂与活细胞不相容性，其不能用于活细胞的成像实验。

Vector Laboratories公司的VectaCell^TM Trolox 抗荧光淬灭剂是专门用于活细胞成像实验使用的抗荧光淬灭剂，该试剂能保持荧光信号强度和时间。并可以保持荧光蛋白或细胞染料在活细胞成像中对光漂白现象的敏感性。

VectaCell^TM Trolox抗淬灭试剂是一种稳定的水溶性的维他命E的形式，该试剂抗光漂白和抗频闪的性能是由于Trolox和其氧化形式Trolox-醌的联合作用。这种氧化还原体系能高效对抗不同的活性氧，比如单质氧，超氧化物阴离子或者过氧化氢。Rebar博士指出，Trolox这种物质对多种细胞均具有保护作用，并呈现低毒性。

因为VectaCell^TM Trolox抗淬灭剂是一种抗氧化剂，这种试剂的最佳工作浓度依赖于细胞类型以及细胞对低氧环境的耐受度。研究者在使用时需要对实验条件进行一些优化。

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