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peprotech ELISA常见问题及解答

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peprotech ELISA常见问题及解答

本篇给各位需要做科研实验的朋友们准备了在使用peprotech生产的ELISA产品时，会遇到的一些常见问题，及解答，希望能够帮助到各位做科研的朋友们。

1. PeproTech ELISA试剂盒中所含的HRP(辣根过氧化物酶)偶联物试剂的稳定性如何？

ABTS ELISA试剂盒中的Avidin-HRP在2-8˚C最多保存一个月，在-20˚C最长可保存2年，此时建议分装冻存，以避免反复冻融。TMB ELISA试剂盒中的Streptavidin-HRP在2-8˚C中可保存半年以上。

2. 我如何知道某个试剂盒的交叉反应信息？

PeproTech在实验室内自行测试了其ELISA试剂盒的交叉反应性，您可在试剂盒的说明书中查看测试结果。

3. ELISA实验过程中如果想周末停一下怎么办？

可以在星期五用包被抗体将板包好，然后放在4˚C保存，下周一再继续实验。请注意：抗体包被时间的改变可能会引起板间结果的差异。

4. PeproTech的EDK是否适用于所有类型的标本？

虽然PeproTech没有用其试剂盒对每种标本进行测试，但这些试剂盒应该适用于(但不仅限于)以下标本：血清、血浆、细胞培养上清液、尿液和唾液。

5. 显色反应需要终止吗？

Avidin-HRP和底物ABTS的显色反应是不需要终止的。当标准品的零孔OD值小于0.2，或最高浓度孔OD值小于1.2时，通常可以获得可靠的标准曲线。如要终止显色反应，可以用1% SDS (十二烷基磺酸钠)作为终止液。虽然资料显示SDS是ABTS的最适终止液，但PeproTech并未在实验室中使用终止液。

对于PeproTech所有的TMB试剂盒，推荐使用终止液(1M HCl)。

6. 对于TMB EDK试剂盒，除620nm的校正波长以外, 还可用哪些波长进行校正？

TMB试剂盒可以用540，570，620或650nm等校正波长。

7. PeproTech的ABTS EDK可以用TMB作为底物吗？

PeproTech的ABTS EDK是用ABTS进行优化的，因此最好使用ABTS作为底物。这些试剂盒也可与TMB配合使用，但需要做一些调整：

•试剂盒中的Avidin-HRP不能与TMB配伍，必须另购链霉亲合素-HRP。

•链霉亲合素-HRP的工作浓度需要优化。

•使用链霉亲合素-HRP和TMB时，通常需用终止液，请按照TMB的厂家说明书操作。

•加终止液前，TMB的反应时间需要优化。

•请使用推荐的酶标板，并在450nm读取吸光值，校正波长为650nm。

8. EDK的组分中为什么要添加D-甘露醇？

在EDK的组分中加入D-甘露醇的目的是使蛋白/抗体可见，这不会影响ELISA的检测结果。

9. 是否可以将EDK说明书中的曲线作为我的标准曲线？

每块ELISA板必须单独做标准曲线，也就是说，一块板的标准曲线不能用于另一块板。PeproTech的EDK说明书中提供的标准曲线是在自己的实验室中做出来的，仅可用作示例。 

10. PeproTech的标准曲线是怎样生成的？

PeproTech在实验室中用Molecular Devices®公司的酶标仪读板，然后用SOFTmax® PRO软件进行结果分析，该软件能将获取的数据进行四参数曲线拟合，公式如下：

四参数曲线拟合(4-P Fit)：

 

x：浓度(pg/ml)

y：OD值(450nm – 650nm)

A, B, C, D对应于标准曲线的四个参数*。

*想了解参数的详细信息，请与我们的质量保证(QA)部门联系。 

详情请咨询Peprotech中国优势代理上海金畔生物科技有限公司

Invivogen基因筛选抗生素常见问题

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Invivogen基因筛选抗生素常见问题

▶ 基因筛选抗生素常见问题

多种筛选抗生素可以用于同一细胞系吗？

可以的，所有的筛选抗生素均可同时或任意组合使用。

为什么在初始细胞培养的过程中不推荐使用筛选抗生素？

我们建议在细胞传代两次之前不要添加筛选抗生素，因为细胞在初始培养过程中是脆弱的，抗生素可能会降低细胞活力。并且耐药标记的充分表达使细胞获得对这些筛选抗生素的耐药性是非常重要的。

如何停用Invivogen的筛选抗生素？

对于停用Invivogen所有的筛选抗生素（Zeocin™, Hygromycin, G418, Phleomycin, Puromycin, and Blasticidin），建议如下：

● 在培养基中加入5%的NaOH（氢氧化钠）和0.1%的NaClO（次氯酸钠）。

● 在室温放置5-10分钟。

该操作能有效地使培养基中的所有抗生素失效。

可以提供Invivogen筛选抗生素在细胞培养基中的半衰期数据吗？

非常抱歉，Invivogen没有关于筛选抗生素在细胞培养中的半衰期数据。Invivogen在测试时是在新鲜培养，而非储备培养基中添加筛选抗生素的。但是如果有需要的话，可以在培养基中补充筛选抗生素，并储存于4℃，储存时间不超过一周。

应该如何储存Invivogen的筛选抗生素？

Invivogen所有的筛选抗生素均在室温下运输，收到之后，可置于4℃短期储存，若要长期储存需置于-20℃。避免重复冻融循环。有效期在产品标签上。

开封之后，在-20℃下可稳定一年时间，但需避免冻融循环。在4℃无菌条件下可稳定3个月的时间。

Invivogen各类筛选抗生素的特性。

产品名称 性质 浓度 工作浓度 拆封后稳定性 抗性基因
潮霉素B（Hygromycin B Gold） 氨基糖苷类抗生素 100mg/mL Cells: 50-200 ug/mL
E.coil: 50-100 ug/mL		 >1year at -20℃
>1year at 4℃		 hph
博莱霉素（Zeocin™） 獒合钢糖肽类抗生素 100mg/mL Cells: 50-400 ug/mL
E.coil: 25 ug/mL
注：请不要使用含Tn5转座因子的大肠杆菌菌株，如MC1066。因为Tn5编码博莱霉素抗性基因，使大肠杆菌菌株对博莱霉素产生抗性。		 Powder:
>1 year at -20℃
1 year at 4℃
Solution:
1 year at -20℃
3 months at 4℃		 Sh ble
腐草霉素（Phleomycin） 糖肽类抗生素 20mg/mL Cells: 5-50 ug/mL
E.coil: 5 ug/mL
注：一般大肠杆菌受体菌株（如HB101、DH5α、MC1061）与携带博莱霉素耐药基因（如Sh ble、 Tn5）的载体转化可对腐草霉素产生抗性		 Powder:
>1 year at -20℃
1 year at 4℃
Solution:
1 year at -20℃
3 months at 4℃		 Sh ble
G418遗传霉素（G418Geneticin） 氨基糖苷类抗生素 100mg/mL Cell: 100 ug/mL- 1 mg/mL（常用浓度为400 ug/mL）
注：G418遗传霉素只能用于筛选和维护表达Neo基因的哺乳动物细胞		 1year at -20℃
3 months at 4℃		 neo
嘌呤霉素（Puromycin） 氨基糖苷类抗生素 10mg/mL Cell: 1-10 ug/mL
注:嘌呤霉素能迅速杀死不含pac基因的真核细胞
E.coil: Puromycin（嘌呤霉素）对大肠杆菌具有很低的活性，但是当低盐LB培养基的pH在7.5-8之间时，可使用100-125 ug/mL的Puromycin（嘌呤霉素）筛选耐嘌呤霉素转化菌株		 1year at -20℃
3 months at 4℃		 Pac
杀稻瘟菌素（Blasticidin） 核苷类抗生素 10mg/mL Cell: 1-10 ug/mL
E.coil: 100 ug/Ml（低盐LB培养基的pH为8时的使用浓度)		 1year at -20℃
3 months at 4℃
注：对于粉末状的杀稻瘟菌素，若重悬之后储存浓度必须大于或等于10 mg/mL才可在-20℃的条件下稳定1年，若浓度低于10 mg/Ml，则无法保证该产品的稳定性。		 bsr

▶ Hygromycin B Gold（潮霉素B）

技术资料中只有Hygromycin B Gold（潮霉素B）在低盐LB培养基中推荐的使用浓度为50-100 ug/ml,但是实验室中只有高盐的LB培培养基，那应该使用多少浓度的Hygromycin B Gold（潮霉素B）呢？

Invivogen推荐在高盐LB的培养基中使用100 – 150 µg/mL的Hygromycin B Gold（潮霉素B）。

将Hygromycin B Gold（潮霉素B）用于哺乳动物细胞时，应使用什么浓度？

将Hygromycin B Gold（潮霉素B）用于哺乳动物细胞时推荐的使用浓度为50-200 ug/ml，也有少数参考文献中提到的使用浓度高达500 ug/ml。建议在正式实验开始前，先确定可杀死宿主细胞系所需要的Hygromycin B Gold（潮霉素B）的最佳浓度。Hygromycin B Gold（潮霉素B）的常用剂量为200 ug/ml，即将原液稀释500倍。关于更多的细节信息，请参考该产品的说明书。

将Hygromycin B Gold（潮霉素B）用于大肠杆菌时，应使用什么浓度？

在低盐LB培养基中推荐使用50-100 ug/ml的Hygromycin B Gold（潮霉素B）筛选耐潮霉素转化菌株。含有Hygromycin B Gold（潮霉素B）的平板培养基可在4℃下稳定1个月。

▶ Zeocin™（博莱霉素）

Invivogen提供的Zeocin™（博莱霉素）是硫酸的还是盐酸的？

Invivogen提供的是硫酸Zeocin™（博莱霉素）。

Zeocin™（博莱霉素）是光敏的吗？

不是的，Zeocin™（博莱霉素）不是光敏的。

Zeocin™（博莱霉素）对pH敏感吗？

是的，Zeocin™（博莱霉素）对pHshiite敏感的，其在低pH值和高pH值(<6和>8)或弱氧化剂存在下会发生不可逆变性。

将Zeocin™（博莱霉素）稀释至工作浓度，推荐使用什么缓冲液？

将Zeocin™（博莱霉素）稀释至工作浓度时推荐使用无菌水。

推荐使用什么浓度的HEPES缓冲液去重悬Zeocin™（博莱霉素）？

用于重悬Zeocin™（博莱霉素）的HEPES缓冲液浓度为5 g/L.

Zeocin™（博莱霉素）应如何储存？

Zeocin™（博莱霉素）在室温条件下运输，收到之后，可置于4℃短期储存，若要长期储存请置于-20℃。

避免重复冻融循环，有效期在产品标签上。

对于粉末状的Zeocin™（博莱霉素），一旦重悬至100 mg/mL，可在4℃条件下储存12个月，在-20℃条件下储存18个月。

对于溶液状的Zeocin™（博莱霉素），开封后，可在-20℃下可稳定一年时间，但需避免冻融循环。在4℃下可稳定3个月的时间，但需置于无菌条件。

将Zeocin™（博莱霉素）用于哺乳动物细胞时，应使用什么浓度？

将Zeocin™（博莱霉素）用于哺乳动物细胞系时推荐的使用浓度为50-400 ug/ml，也有少数参考文献中提到的使用浓度低至20 ug/mL，或高至1000 ug/mL。建议在正式实验开始前，先确定可杀死宿主细胞系所需要的Zeocin™（博莱霉素）的最佳浓度。关于更多的细节信息，请参考该产品的说明书。

将Zeocin™（博莱霉素）用于大肠杆菌时，应使用什么浓度？

在低盐LB培养基中推荐使用25 ug/mL的Zeocin™（博莱霉素）筛选耐博莱霉素转化菌株。

注意：不要使用含Tn5转座因子的大肠杆菌菌株，如MC1066。因为Tn5编码博莱霉素抗性基因，是大肠杆菌菌株对Zeocin™（博莱霉素）产生抗性。

▶ Phleomycin（腐草霉素）

Phleomycin（腐草霉素）应如何储存？

Phleomycin（腐草霉素）室温条件下运输，收到之后，可置于4℃短期储存，若要长期储存请置于-20℃。

避免重复冻融循环，有效期在产品标签上。

对于粉末状的Phleomycin（腐草霉素），一旦重悬至20 mg/mL，可在4℃条件下储存12个月，在-20℃条件下储存18个月。

对于溶液状的Phleomycin（腐草霉素），开封后，可在-20℃下可稳定一年时间，但需避免冻融循环。在4℃下可稳定3个月的时间，但需置于无菌条件。

将Phleomycin（腐草霉素）用于哺乳动物细胞时，应使用什么浓度？

将Phleomycin（腐草霉素）用于哺乳动物细胞系时推荐的使用浓度为5-50 ug/ml。建议在正式实验开始前，先确定可杀死宿主细胞系所需要的Phleomycin（腐草霉素）的最佳浓度。关于更多的细节信息，请参考该产品的说明书。

将Phleomycin（腐草霉素）用于大肠杆菌时，应使用什么浓度？

在低盐LB培养基中推荐使用5 ug/mL的Phleomycin（腐草霉素）筛选耐腐草霉素转化菌株。

注意：一般大肠杆菌受体菌株（如HB101、DH5α、MC1061）与携带博莱霉素耐药基因（如Sh ble、 Tn5）的载体转化可对Phleomycin（腐草霉素）产生抗性。

▶ G418（遗传霉素）

同时购买的两瓶G418遗传霉素均置于-20℃储存，为什么其中一瓶会凝结成固体，而另外一瓶则是完全透明的液体？

Invivogen实验室也有注意到同样的现象。由于液体的结冰反应需要扰动才可以进行，所以即使在0℃以下，溶液的结冰反应也不可自发进行。这种扰动可以是震动、冲击等。因此不同管G418凝固的差异可以解释为对其中一管的G418有一个小的冲击或震动，而未碰触到其他管。

注意，液体中的凝固反应是一个连锁反应，一旦发生便可迅速扩散到整个可用的溶液。

应如何让储存G418?

G418在室温下运输。收到之后，请置于4℃短期储存，若要长期储存请置于-20℃。避免重复冻融循环，有效期在产品标签上。

一旦拆封，-20℃条件下储存可稳定一年，期间需避免重复冻融循环。4℃无菌条件下储存可稳定3个月。

将G418用于哺乳动物细胞时，应使用什么浓度？

G418用于筛选和维护转染neo基因的哺乳动物细胞系的工作浓度取决于多种因素，例如细胞类型。因此，我们建议正式实验开始之前使用不同浓度的抗生素（例如100 ug/mL- 1 mg/mL）处理细胞，以确定杀死宿主细胞系所需的最佳抗生素浓度。请注意：G418常用剂量为400 ug/mL。

是否可以使用G418在大肠杆菌中筛选含有Neo基因的质粒？

不可以的。G418只能在表达Neo基因的哺乳动物细胞中使用。对筛选表达Neo基因的大肠杆菌转化子建议使用 Kanamycin（卡那霉素）。

▶ Puromycin（嘌呤霉素）

应使用什么缓冲液重悬Puromycin（嘌呤霉素）？

Invivogen推荐使用HEPES缓冲液 （5 mM, pH 7.3）重悬Puromycin（嘌呤霉素）。

将Puromycin（嘌呤霉素）置于-20℃储存时出现结晶固体，是否正常？

是正常的，在储存过程中可能会形成Puromycin（嘌呤霉素）的结晶沉淀。如果发生此情况，请将产品置于37℃下加热30分钟，直到结晶沉淀消失。结晶沉淀的形成并不影响产品的活性。

应如何储存Puromycin（嘌呤霉素）?

Puromycin（嘌呤霉素）在室温下运输。收到之后，可置于4℃短期储存，若要长期储存请置于-20℃。避免重复冻融循环，有效期在产品标签上。

一旦拆封，-20℃条件下储存可稳定一年，期间需避免重复冻融循环。4℃无菌条件下储存可稳定3个月。

将Puromycin（嘌呤霉素）用于哺乳动物细胞时，应使用什么浓度？

Puromycin（嘌呤霉素）用于筛选哺乳动物细胞系的工作浓度为1-10 ug/mL。我们建议正式实验开始之前使用不同浓度的抗生素处理细胞，以确定杀死宿主细胞系所需的最佳抗生素浓度。请注意：Puromycin（嘌呤霉素）能迅速杀死不含pac基因的真核细胞。更多的细节信息，请参考本产品说明书。

将Puromycin（嘌呤霉素）用于大肠杆菌时，应使用什么浓度？

Puromycin（嘌呤霉素）对大肠杆菌具有很低的活性，但是当低盐LB培养基的pH在7.5-8之间时，可使用100-125 ug/mL的Puromycin（嘌呤霉素）筛选耐嘌呤霉素转化菌株。

▶ Blasticidin（杀稻瘟菌素）

应如何储存Blasticidin（杀稻瘟菌素）？

Blasticidin（杀稻瘟菌素）在室温下运输。收到之后，可置于4℃短期储存，若要长期储存请置于-20℃。避免重复冻融循环，有效期在产品标签上。

一旦拆封，-20℃条件下储存可稳定一年，期间需避免重复冻融循环。4℃无菌条件下储存可稳定3个月。

注意：对于粉末状的Blasticidin（杀稻瘟菌素），若重悬之后储存，其浓度必须大于或等于10 mg/mL才可在-20℃的条件下稳定1年，需注意避免重复冻融循环。如果储存时浓度低于10 mg/mL,则无法保证该产品的稳定性。

将Blasticidin（杀稻瘟菌素）用于哺乳动物细胞时，应使用什么浓度？

Blasticidin（杀稻瘟菌素）用于筛选哺乳动物细胞系的工作浓度为1-10 ug/mL，也有少数参考文献中的使用浓度高达30 ug/mL。我们建议正式实验开始之前使用不同浓度的抗生素处理细胞，以确定杀死宿主细胞系所需的最佳抗生素浓度。更多的细节信息，请参考本产品说明书。

将Blasticidin（杀稻瘟菌素）用于大肠杆菌时，应使用什么浓度？

Blasticidin（杀稻瘟菌素）对大肠杆菌具有很低的活性，但是当低盐LB培养基的pH为8时，可使用100 ug/mL的Blasticidin（杀稻瘟菌素）筛选耐杀稻瘟菌素转化菌株。注意：高pH值可提高杀稻瘟菌素的活性。

更多详情请联系InvivoGen中国代理商上海金畔生物

Cosmobio水凝胶常见问题

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Cosmobio水凝胶常见问题

Cosmobio水凝胶

http://export.cosmobiousa.com/contents/detail.php-product_id=6232.html

◆ 物理特性

● 当温度高于37℃，甚至高于60℃时，水凝胶将会发生什么变化？

随温度升高水凝胶将会变硬。

● 在0-60℃温度范围内，溶胶/凝胶/水凝胶发生相态变化的温度范围分别是多少？凝胶相可逆变化的温度范围是多少？

0℃-15℃：溶胶

15℃-20℃：溶胶和凝胶的中间体

20℃：相态变化的温度转折点

20℃以上：水凝胶

37℃以上：随温度升高，水凝胶开始变硬。

● 二氧化碳和营养物质是如何供给细胞的？在水凝胶状态下可以溶解到细胞内吗？

可以的，营养物质和二氧化碳在水凝胶中通过多层营养培养基扩散进入细胞。

● 温度为37℃时水凝胶的结构强度是多少?

关于此问题，请参考以下的参考文献：

Yoshioka H et al, A Synthetic Hydrogel with Thermoreversible Galation and Rheological Properties, Journal of Macromolecular Science, Part A: Pure and Applied Chemistry Volume 31, Issue 1, 1994

● 水凝胶上有小孔吗？

水凝胶上没有任何空隙或小孔。

● 凝胶对二氧化碳、氮气和氧气是可渗透的吗？

是的，二氧化碳、氮气和氧气的可以通过凝胶渗透。

● 当Mebiol Gel®处于水凝胶状态时，细胞会被水凝胶包围，那有足够的空间供细胞生长吗?

即使当Mebiol Gel®处于凝胶状态即37℃时，其交联点也是可变的，即会随细胞形态的变化而变化，且没有空隙或间隙。

● 在适当的温度下，Mebiol Gel®从溶胶变成凝胶需要多长时间？

3分钟

● 溶胶-凝胶的转换可以重复多少次？

正常情况下溶胶-凝胶相互转换可重复多次，直到Mebiol Gel®被化学分解。另外，溶胶-凝胶相互转换的次数取决于稀释后的储存温度或氧密度。稀释后若置于4℃储存，Mebiol Gel®可稳定1-2个月的时间，若分装后置于-20℃或-80℃储存，则可稳定更长的时间。

● 多大分子量的营养物质可通过凝胶？营养物质的移动距离与分子量之间有什么相关性呢？

可通过37℃水凝胶扩散的营养物质的最大分子量约为10000‐90000（确切尺寸未知）。如果营养物质的分子量为数千，即1000-9000，在凝胶中扩散是没有问题的。但如果营养物质的分子量超过9000，那在扩散的时就有问题了。营养物质自身的分子量越小，在水凝胶中移动的距离就越长。

● 是否可以提供在37℃时水凝胶的孔隙率数据？

非常抱歉，Cosmobio没有任何关于凝胶孔隙率的数据。但是，以下参考文献的讨论部分有关于“凝胶在不同材料中的扩散速度”的信息，可供参考。

Takao et al., Novel drug delivery system using thermoreversible gelation polymer for malignant glioma Journal of Neuro-Oncology (2005)

一般情况下，当凝胶浓度较低时，凝胶在物料中的“扩散速度”较高。因此当凝胶浓度较低时，凝胶孔隙度较高。但当凝胶浓度较低（如5%）时，不会形成凝胶。

● Mebiol Gel®最小凝胶质量分数（wt%）是多少?

最小的胶浓度大概是7 wt%。Cosmobio推荐加1 g的聚合物至10 g培养基中，这样制出来的胶浓度为9 wt%

◆ Mebiol Gel®和兼容的细胞类型问题

● 当在37℃下培养细胞时，是否可以交换培养基的类型？

当处于37℃时，凝胶不会溶于过量的水。因此，您可以将凝胶上的培养基分层，这样就可以交换分层后的培养基。

● 当细胞在生长过程中接触到水凝胶的边缘时会受到任何阻力吗?

不会。

● Mebiol Gel®是否适用于T细胞或MSC细胞的培养?

Cosmobio没有任何关于在Mebiol Gel®中培养T细胞的数据。关于MSC细胞培养，请参考以下的参考文献：

Yuguo Lei et al., PNAS PLUS E5039E5048 doi: 10.1073/pnas.1309408110

● 请问Mebiol Gel®已经成功培养过哪些类型的细胞？

请参考Cosmobio官网所列的使用Mebiol Gel®培养细胞已经发表的参考文献，链接如下：

http://export.cosmobiousa.com/contents/mebiol_lit_ref.html

● 请问可以使用Mebiol Gel®培养人肺上皮细胞吗？是否可以提供相关的参考数据？

非常抱歉，Cosmobio没有任何关于使用Mebiol Gel®培养人肺上皮细胞的数据。

● Mebiol Gel®是否已经被报道用于培养肠细胞？是否有可支持的参考文献？

非常抱歉，Cosmobio没有任何关于使用Mebiol Gel®培养肠细胞的数据。

● 在溶液状态下，提取细胞时是否会损伤细胞？

不会的。

● Mebiol Gel®是否可被用于流式细胞术？如果可以的话应该使用哪种状态的凝胶？

可以的，当Mebiol Gel®在低温下处于溶胶状态是可以被用于流式细胞术。

● Mebiol Gel®是否可被用于体内实验？如果可以的话，它可以在小鼠体内保留多长时间？

可以的，Mebiol Gel®可以被用于除人以外的其他物种的体内实验。它可以以凝胶的形式在大鼠脑内保留至少28天。更多的信息可以参考以下的参考文献：

T. Ozeki, K. Hashizawa, D. Kaneko, Y. Imai, H. Okada, “Treatment of rat brain tumors using sustained-release of camptothecin from poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres in a thermoreversible hydrogel”, Chem. Pharm. Bull. 58 (9), 1142-1147 (2010)

● Mebiol Gel®对细胞具有毒性吗？如果有的话，对哪些类型的细胞可能会产生毒害作用？

Mebiol Gel®对所有的细胞均是无毒的。

● 有关于使用Mebiol Gel®培养正常或癌变的甲状腺细胞的参考文献吗？

有的，请参考以下已发表文献：

Production of hepatitis C viruses (HCV) by 3-D culture of human hepatocyte cell line・ “Production of infectious hepatitis C virus particles in three-dimensional cultures of the cell line carrying the genome-length dicistronic viral RNA of genotype 1b“ Virology, 351 (2), 381-392 (2006)


◆ 其他问题

● Mebiol Gel®可以室温储存吗？

可以的，粉末状的Mebiol Gel®应置于室温储存。

● Mebiol Gel®的有效期是多久？

Mebiol Gel®的有效期为发货之日起一年。

● Mebiol Gel®一次性未能用完，若将剩余的凝胶置于4℃储存，可储存多长时间？

大约一个月的时间，若要长期储存，请置于-20℃或-80℃。

● Cosmobio可以提供Mebiol Gel®的试用装吗？

非常抱歉，Cosmobio不提供Mebiol Gel®的试用装。

● Cosmobio如何对Mebiol Gel®进行消毒？凝胶里会有一些活体生物吗？

Cosmobio使用EOG对凝胶进行消毒，凝胶里应该不含任何生物。

● 当使用10 mL和50 mL的Mebiol Gel®培养细胞时，应该使用多大规格的培养瓶？

应分别使用T-25和T-75的培养瓶。

● 当重悬Mebiol Gel®时，可以使用质量分数为20%的Mebiol Gel®作为储存原液，而非10%吗？因为我希望在后续的实验中使用其他类型的培养基去进一步稀释。

可以使用20%的Mebiol Gel®代替10%的作为储存原液。但是，请注意20%的高浓度重悬液具有很高的粘度，即使在低温下也具有较低的流动性。

● 说明书中推荐使用10 mL的培养基溶解Mebiol Gel® (MBG-PMW20-1001)。可以使用更大体积的培养基去溶解吗？

一般情况下，Cosmobio推荐使用10 mL的培养基溶解10 mL的Mebiol Gel®。如果您希望溶解50 mL的Mebiol Gel®，则需要加入50 mL的培养基。如果低于这个浓度的Mebiol Gel®溶液，则很难形成凝胶。例如，如果您使用20 mL的培养基去溶解10 mL的Mebiol Gel®，则很难获得凝胶。

● 每瓶中含有多少克的Mebiol Gel®？

10 mL规格的Mebiol Gel®溶液中含有1.0 g的Mebiol Gel®，50 mL的Mebiol Gel®溶液中含有5.0 g的Mebiol Gel®。

● 包装瓶中的粉色药片是什么？

是氧气检测试剂。与Mebiol Gel®一起，作为氧气和水分的吸收剂，但非产品的一部分。

● 可以制备的Mebiol Gel®凝胶浓度最高是多少？

最高浓度大约为15 wt%。如果浓度再高，其黏性会随着浓度的升高而增大，进而导致Mebiol Gel®即使在低温状态下也无法使用，例如在20 wt%浓度下就已经无法使用

详情请咨询Cosmo Bio全国代理-上海金畔生物科技 

Peprotech细胞因子溶解稀释常见问题

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Peprotech细胞因子溶解稀释常见问题

Peprotech的细胞因子或重组蛋白以冻干粉的形式提供，无任何添加剂、赋形剂及蛋白载体，这使得细胞因子或重组蛋白非常稳定，在-20℃或-80℃可稳定保存数年，并且使用非常安全，对实验结果影响较小。冻干粉在使用前需进行溶解，以溶液的形式加入到培养体系或注入动物体内。溶解步骤非常关键，溶解不好会导致细胞因子或重组蛋白的活性降低或丧失，这也是许多客户经常遇到的问题。

 

那么应该如何进行正确的溶解呢？

下面以Recombinant Human IL-4（重组人IL-4，产品编号：200-04）的说明书（COA）为例，对细胞因子或蛋白的溶解方法进行详细的阐述。

拿到重组人IL-4的说明书后，您会发现有一段关于Reconstitution（重悬）的叙述，这段内容含有溶解相关的所有信息。

1. Centrifuge the vial prior to opening

第 1 步：开盖前离心试剂管

PeproTech 的细胞因子或蛋白冻干粉装盛在塑料管中，为无菌包装。冻干粉在运输过程中可能会因颠簸而漂散并粘贴于管壁或管盖上，所以在打开塑料瓶盖前，需将冻干粉通过离心收集到管底，以便用很小体积的液体即可将冻干粉完全溶解。

 

有很多用户会问一个问题，即应该用多少转速、多长时间离心试剂管，才能达到良好的收集效果？

答：有些小型高速离心机（多为进口品牌）的面板上有一个 Spin 键，按了此键后，离心机会自动快速上升到其最大速度(10000rpm 或 12000rpm)，上升到最高点后速度即刻下降，直至停止旋转，整个过程大约 30s。这个 Spin 键足以很好的将细胞因子或蛋白收集到管底。

但有些实验室没有这样的高速离心机，只有最高转速为 4000-4500rpm 的离心机。这种情况下，需 3000-3500rpm 离心 5min，也能达到类似的效果。

2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do not vortex.

第 2 步：用无菌水重悬至 0.1-1.0 mg/ml ，不可振荡。

这个步骤即为溶解步骤，非常重要。

1）一定要用推荐的溶液重悬（或溶解）冻干粉

用于溶解细胞因子或蛋白的溶液千差万别。此例中的重组人 IL-4 需用水溶解，而重组人 IL-2 （产品编号：200-02）则需用 100mM Acetic Acid （醋酸）溶解，重组人TGF-beta1 （产品编号：100-21）需用 10mMCitric Acid（柠檬酸），pH3.0 溶解，重组人FGF-basic（产品编号：100-18B）需用 5mMTris，pH7.6 溶解，重组人FGF-10（产品编号：100-26）需用5mMSodium Phosphate（磷酸钠），pH7.4 溶解，重组IL-13（产品编号：200-13）需用 20mMMHCl溶解。（注：即使同一重组细胞 因子或蛋白，不同批次的溶解方法也可能有所不同，因此上面的叙述仅供参考。 具体应该如何溶解应以相应批次的官方说明书为准）。

 

经常会有客户问，为什么有多种溶解方法？

答：我们知道，蛋白的溶解性与很多因素有关，其中比较重要的是 pH 值和离子强度。PeproTech 的细胞因子或重组蛋白在出厂前均经严格测试，说明上所标明的溶解液是能够将该细胞因子或重组蛋白完全溶解的液体。如果您所用的溶解液的pH 值和离子强度与说明书中所标明的不符，很多时候会造成细胞因子或重组蛋白不能完全溶解或者根本无法溶解，这样所配得的细胞因子或重组蛋白必然活性不够或丧失。


有不少用户没注意说明书上的描述，而是根据习惯，直接用 PBS 或培养液（1640或 DMEM等)等溶解细胞因子或蛋白的冻干粉。这样做可以吗？

答：有时可以，要看具体情况。PeproTech 的大多数细胞因子或蛋白冻干粉的溶解液不是 PBS，此时千万不能用 PBS 或培养液直接来溶解，具体原因在上面已经叙述过。而有部分细胞因子，如重组人 KGF(产品编号：100-19)和重组人FGF-23(产品编号：100-52)等，说明书上的溶解液即为 1x PBS，此时用 PBS溶解完全没问题，那么用培养液溶解也是可以的，不过最好还是用先用 PBS溶解，然后再用培养液稀释。

2）一定要溶解到指定的浓度。

蛋白在一定的浓度范围内可以保持良好的稳定性，这个范围就是说明书上所标明的浓度范围，该例为 0.1-1.0 mg/ml。这个浓度范围对于不同的细胞因子或重组蛋白是不同的。如重组人FGF-6（产品编号：100-30）为 0.5-1.0mg/ml，而重组人Activin B（产品编号：120-15）则一定要是0.5mg/ml。

 

高于或低于该浓度范围会有什么问题呢？

答：首先，细胞因子或蛋白会不稳定，即很容易出现活性下降的现象。其次，高于这个浓度范围，可能会超过该蛋白的最大溶解浓度，即蛋白无法完全溶解。再者，高于或低于该浓度范围，蛋白可能会出现聚集（aggregation），最终结果还是部分蛋白未溶解，导致蛋白活性的减弱。

3）一定不能振荡(vortex)。

这里所说的振荡是指用涡旋仪进行快速振荡。

 

有用户会问，若想保证溶解液与冻干粉充分混匀，以实现细胞因子或重组蛋白的完全溶解，该怎么办呢？

答：多数细胞因子或重组蛋白的冻干粉是非常容易溶解的，一般我们用移液枪的枪头轻吹几下，即可使细胞因子或重组蛋白完全溶解。对于不易溶解的细胞因子或蛋白，PeproTech 会在说明书中进行备注（Note）。如在重组人 IL-13（产品编号：200-13）的说明书中您会看到：Slow to dissolve （缓慢溶解），在重组人 IL-11（产品编号：200-11）的说明中会看到：This solution is slow to dissolve.（该溶液溶解缓慢）。这种情况下，您最好能将要溶解的细胞因子或重组蛋白放在水平摇床（shaker）上低速摇一段时间，促使细胞因子或重组蛋白完全溶解。有些蛋白，如重组人 IL-13 Variant （产品编号：200-13A）虽然难溶，但却不需用摇床来加速溶解。其说明书上的备注为：Allow the reconstituted vial to sit at 4℃ for at > 2 hours before use.（将重悬液在 4℃静置2小时以上）。

The solution can be stored at 2-8℃ for up to one week.

第3步：该重悬液在2-8℃最长可保存1周。

用说明书上推荐的溶液重悬细胞因子或重组蛋白至推荐的浓度后，可置于2-8℃储存，在此条件下其活性最长可保持1周。这对于周期为5-7天的实验，如DC（树突状细胞）的诱导成熟是足够的。在此期间，只要每次从冰箱里吸取一定量的细胞因子或重组蛋白重悬液加入到培养体系即可。一般说明书上推荐的重悬浓度要高于实验时使用的浓度，此时可能需要对重悬后的溶液进行稀释。如需进行稀释，必须遵循第4步中的方法要求，使用含载体蛋白的溶液进行稀释。否则稀释后的细胞因子或重组蛋白很容易粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中细胞因子的或重组蛋白的浓度下降，总的蛋白活性大为减弱。

For extended storage, it is recommended to further dilute in a buffer containing a carrier protein(example 0.1% BSA) and store in working aliquots at -20℃ to -80℃。

第4步：如果要长期保存，需使用含载体蛋白（如0.1% BSA，或10% FBS，或5% HSA）的溶液进一步稀释，然后分装冻存于-20℃至-80℃。

如果实验周期长于一周，或配制的细胞因子或蛋白一次用不完，则需对细胞因子或重组蛋白进行长期保存。方法：将已重悬的细胞因子或蛋白用含载体蛋白，如0.1% BSA（牛血清蛋白），10% FBS（胎牛血清），5% HSA（人血清白蛋白）的溶液进一步稀释，然后分装冻存于-20℃至-80℃。

经常有客户使用COA上推荐的溶液重悬细胞因子或重组蛋白冻干粉后不使用含载体蛋白的

 

溶液进行稀释，而是直接分装冻存于-20℃至-80℃，这样可以吗？

答：不可以的。我们知道塑料管壁对多数蛋白均具有很好的吸附作用，也就是说溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后，蛋白是很难与管壁分离的，例如ELISA的包被抗体（Capture antibody）就是通过这种粘附作用包被到酶标板上的。

载体蛋白，如0.1% BSA（牛血清蛋白），10% FBS（胎牛血清），5% HSA（人血清白蛋白）的主要作用是预先封闭塑料管壁上的蛋白结合位点，使细胞因子或重组蛋白不会粘附于管壁。如果在细胞因子或重组蛋白冻干粉用推荐的溶液重悬后不用含载体蛋白的溶液进一步稀释，而直接分装冻存，则溶液中的大部分细胞因子或重组蛋白均会粘附到管壁上，导致溶液中实际溶解的细胞因子或重组蛋白浓度大为降低，最终表现为细胞因子或重组蛋白活性下降。因此，在分装冻存时，一定要用含载体蛋白的溶液将重悬液进一步稀释。稀释后的细胞因子或重组蛋白可为任意浓度，因为大量的载体蛋白可以保证任意浓度细胞因子或重组蛋白仍然维持较高的稳定性。一般情况下，推荐的稀释倍数是原重悬浓度的5-10倍，稀释后的细胞因子或重组蛋白的浓度不低于10 ug/ml。

 

那么，含载体蛋白的溶液是什么溶液呢？水可以吗？

答：水是不可以的。该溶液通常是指pH接近中性，有一定缓冲能力的缓冲液，如PBS，培养液（RPM1640，DMEM等）等。

还有一个经常被问及的问题，即在做无血清培养或动物体内实验时，细胞因子中不能含有

 

BSA、FBS或HSA等动物或人的蛋白，想要长期保存细胞因子或重组蛋白应该怎么办呢？

答：一种方法是订购Peprotech的小包装（Size A）细胞因子或重组蛋白，每次使用一支，用后即废弃。如觉得此方法过于浪费，可使用5%海藻糖（Fucose）作为载体，用含海藻糖的溶液来稀释已经重悬的细胞因子或重组蛋白，然后分装冻存。

更多详情请联系Peprotech中国代理商上海金畔生物

Invivogen细胞常见问题

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Invivogen细胞常见问题

收到细胞后，首次进行培养，应该注意些什么？

收到细胞后最重要的步骤是解冻，但亚洲的客户无需进行此步骤，因为Invivogen将细胞运往亚洲地区时使用的是细胞培养板在常温下运输。收到细胞后需要立马进行传代培养，不要放在-80℃或者液氮中，因为这会损伤细胞。

我在HEK和THP1细胞的初始培养过程中有困难，请问有什么建议可以参考吗？

如果您在初始培养细胞的过程中遇到任何问题，请参考以下的建议：

● 对于前2-3次传代的细胞，应置于含20%胎牛血清且无抗生素的培养基中培养。但此条件下培养细胞时间不宜过长，2-3代之后的细胞应使用含10%胎牛血清的培养基进行培养。

● 请定期检查细胞状态，不要使细胞的汇合度达到100%。

● 当冻存细胞时，请继续培养其他未冻存的细胞，以防冻存细胞有问题。

如果你正在培养THP1细胞，以下是额外需要注意的地方：

● 对于THP1细胞，我们建议细胞浓度在3 x 105 -7 x 105 cells/mL时进行传代，一般为5 x 105 cells/mL。如果低于这个浓度，细胞将需要很长时间才能生长，如果高于2 x 106 cells/mL，则可能会产生毒性。

● 在每次传代之间，请不要使用离心机分离细胞。THP1细胞在条件培养基中生长的会更好，因此当传代时，不要弃去上一代培养细胞时所使用的全部培养基，留1-2 mL，并加入新鲜的培养基。但是原来培养基的占比不能超过50%，因为这样会导致细胞无法获得足够的营养去生长。

为什么要在细胞传代2-3次之后才可加入筛选抗生素？

由于最初的耐药标记物水平较低，细胞对筛选抗生素会更加敏感。因此，建议等待2 – 3代后再添加筛选抗生素，以避免在前几代时对细胞造成进一步的应激。

建议用什么血清来培养InvivoGen的细胞?

建议使用无内毒素的血清来培养报告细胞系。InvivoGen在培养细胞时，会要求供应商提供其所使用血清的COA，以确保低水平的内毒素，以免激活NF-kB通路。

细胞培养基中应添加多少浓度的青霉素或链霉素？

建议使用100 U/mL的青霉素和100 µg/mL链霉素。

如果用于细胞培养的培养基中所含的L-glutamine（L-谷氨酰胺）浓度与说明书中不一致会有问题吗？

没有问题的，只要培养基中L-谷氨酰胺的浓度不低于2 mM就可以。大多数DMEM配方中含有4mM的L-谷氨酰胺，但一般情况下培养基中含有2 mM的L-谷氨酰胺即可维持细胞的正常生长。

细胞培养过程中可以使用谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物GlutaMax吗？

谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物GlutaMax均已通过测试，可以使用，在使用过程中与添加L-谷氨酰胺的细胞相比未发现有任何差异。

为什么推荐使用热灭活的血清培养细胞？

许多InvivoGen的细胞系都是通过SEAP（分泌型胚胎碱性磷酸酶）报告系统进行改造的。在很多情况下胎牛血清（FBS）中含有的微量碱性磷酸酶（AP）会干扰检测结果。因此，为了降低背景干扰，建议使用灭活血清培养Invivogen的所有细胞。

有灭活胎牛血清（FBS）的操作方法吗？

实验室中建议在56℃中加热30分钟来灭活血清。灭活时，需要等水浴温度达到56℃之后再将含血清的试管放入，以确保血清完全灭活。

冷冻培养基必须含有灭活的胎牛血清（FBS）吗？

实验时我们通常使用含灭活胎牛血清（FBS）的冷冻培养基，生长培养基及测试培养基。然而，如果您在冷冻培养基中使用非灭活的血清也是没有问题的。

在培养HEK细胞时没有贴壁，应如何处理呢？

当HEK-Blue™细胞没有贴壁时，要么是开始培养时稀释过度，要么是在培养瓶中融合过度窒息而死。

以下建议可使您在后续培养中避免出现这种问题：

● 改变培养基，在T25培养基中以1.5×10^6 cells/mL培养细胞。

● 建议将细胞转入新的培养瓶之前要清洗细胞。有时细胞难以贴壁是因为活细胞与死细胞聚集成簇。已因此清洗细胞以去除影响细胞贴壁的DMSO。

● 使用含20%胎牛血清（FBS）的培养基培养细胞。

● CellBIND表面细胞培养瓶的使用会促进细胞贴壁及生长，然而，一般的细胞培养过程中不需要使用表面细胞培养瓶。

培养THP1细胞时细胞分裂一次需要一周的时间是正常的吗？

细胞分裂一次需要一周的时间是不正常的。由于细胞克隆的不同，通常情况下THP1细胞分裂一次需要24-72个小时。培养THP1细胞时需保证细胞的浓度大于或等于5 x 105 cells/mL。Invivogen的研发团队已经注意到当稀释过度时会出现死亡。此外，在等待细胞改善的过程中不要添加Normocin™。

如果THP1细胞在生长过程中出现聚集成团但未死亡应该怎么办呢？

只要细胞生长很好，形态正常，细胞抱团生长是没有问题的。因为死细胞的存在可能是导致细胞抱团生长的原因，所以您可以离心去除死细胞。请注意，我们建议您在进行化验前均质细胞。

应如何从活细胞中去除死细胞？

推荐使用120 G转速离心10分钟。

可以提供一些减少HEK-Blue™细胞背景信号的建议吗?

● 为减少实验中的背景信号，需在刺激之前一直NF-kB的活性。

● 实验分析时使用至少传代24小时的健康细胞。

● 确保细胞的汇合度不超过80%。

● 使用预热的PBS清洗细胞。

● 使用灭活的胎牛血清（FBS）培养细胞（清除血清中残留的碱性磷酸酶）。

● 进行细胞刺激之前不要离心。

● 每个孔板中不要加入过多的细胞（推荐每孔中加入大概50000细胞）。

为什么在检测培养基中不推荐加入NormocinTM？可以在检测培养基中添加筛选抗生素吗？

不建议在检测培养基中添加NormocinTM是因为在进行检测时要减少培养基中潜在的干扰因素。因此也不推荐在检测培养基中添加其他筛选抗生素。

当使用数量相同但传代数不同的细胞及浓度相同的配体实验时，可以得到类似的结果吗？

这很难说，因为很难预测传代数对实验结果的影响。但是在我们的实验中使用传代数不同的细胞对实验结果的影响是非常小的。

Invivogen的细胞系可以用于其它实验吗？例如ELISA和Western blotting.

是的，Invivogen的细胞系是可以用于ELISA和Western Blots的。然而，我们没有做过此类验证。

Invivogen的细胞系可以用于定量检测吗？

它们是半定量测试。然而，它们可以通过使用阳性对照制作标准曲线来用于定量测量。

是否可以将刺激后的上清液冷冻，以便日后读取/检测SEAP的产量?

如果您不能立即进行检测实验，可将上清样本储存于4℃，但储存时间不可超过一周。如果需要更长时间的储存，可将其置于-20℃。但在此条件下推荐使用含20%胎牛血清（FBS）的检测培养基，以在冷冻过程中尽量保护SEAP不受损害，请不要重复冻融循环。

如果实验中需要使用抑制剂处理细胞，是用抑制剂单独预处理细胞还是配体与抑制剂共孵育后处理细胞?

这由抑制剂所决定。如果抑制剂阻断了信号通路中的受体或元素，我们建议将抑制剂与细胞预孵育至少30分钟。如果抑制剂结合或阻断配体(即针对特定细胞因子的抗体)，那么最好在添加到细胞之前将抑制剂与配体预孵育。

在刺激之前，细胞需要接种多长时间？

在加入配体时应同时接种细胞（先加配体）。

对于贴壁细胞应该使用什么冷冻培养基？

对于贴壁细胞，推荐使用DMEM，20%(v/v)的胎牛血清（FBS）和10%(v/v)的DMSO。

对于悬浮细胞应该是什么冷冻培养基？

对于悬浮细胞，推荐使用胎牛血清（FBS）和10%的DMSO。


如果冻存步骤未成功，应如何处理？

以防出现类似的问题，Invivogen强烈建议在解冻冻存的细胞之前维持培养细胞培养板中未冻存的细胞处于正常生长状态。

SEAP的产生需要NF -κB和AP-1转录因子的激活，还是仅仅激活一个转录因子就可以得到信号?

Invivogen的报告细胞系仅需要激活一个转录因子（NFκB 和/或 AP-1）就可以得到信号。

Lucia™荧光素酶来自于什么物种?

InvivoGen的荧光素酶是完全合成的，不属于任何天然荧光素酶。

更多详情请联系 InvivoGen 中国代理商上海金畔生物

Peprotech细胞因子其他常见问题

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Peprotech细胞因子其他常见问题

其他常见问题

● Peprotech细胞因子的稳定性如何？ 

除特殊说明之外，Peprotech的细胞因子或重组蛋白均以冻干粉形式提供，这使得细胞因子或重组蛋白在室温条件下便非常稳定。尽管如此，还是建议将细胞因子或重组蛋白置于-20℃或-80℃储存，可稳定数年。

重悬后的细胞因子或重组蛋白，在4℃条件下可短期储存1-2周左右的时间，具体请参考具体产品的COA。若要长期储存，需使用含载体蛋白的溶液稀释已重悬的细胞因子或蛋白，分装后请置于-20℃或-80℃储存。为避免蛋白部分变性，在冻存期间请避免重复冻融循环。


● PeproTech细胞因子的内毒素水平如何？ 

PeproTech大部分无动物成分级别细胞因子的内毒素水平均保证低于0.01 ng/µg蛋白，即0.1 EU/µg蛋白。对于大多数非无动物成分级别的细胞因子，内毒素水平保证低于0.1 ng/µg蛋白，即1 EU/µg。事实上许多细胞因子的实际内毒素含量均低于说明书上标注的内毒素水平。


● ED50和units/mg均用来表示比活性(specific activity)，两者之间有什么关联？ 

ED50的定义是可诱导50%最大反应的细胞因子浓度，而比活性(specific activity)是单位重量蛋白样品中所含的活性单位。比活性单位(Specific Activity Units)只能用于表示蛋白的效能，且仅适用于剂量反应曲线为S形的蛋白。以ng/ml为单位的ED50和以units/mg为单位的比活性之间的换算公式为：
Peprotech细胞因子其他常见问题


● 比活性单位(specific activity units)和活性的国际单位(International Units)之间有什么关联？

比活性单位和国际单位(IU)之间没有直接的关联，不能相互换算。

国际单位(IU)是与国际标准品的活性单位(即IU/ng)比对后得出的活性数值，后者是在世界卫生组织(WHO)领导的国际合作研究中确定的。WHO国际标准品由英国国家生物制品检定所(NIBSC)制备和提供。

简单地与国际标准品比对而得出的蛋白活性国际单位(IU)常会出现偏差，原因是每个蛋白厂家所用的活性检测方法很难一致，从而导致与国际标准品比对后得到的国际单位(IU)值相互间不具可比性。想要实现真正的可比性，必须建立标准的活性检测方法，以保证所得出的蛋白活性国际单位(IU)值仅与蛋白的质量有关，而与蛋白的来源无关。


● PeproTech是怎样得到蛋白活性的国际单位(IU)值的？ 

在可能的情况下，PeproTech通过将自己的产品与对应的WHO标准品在自已的生物活性测试中进行多次平行比对来得出国际单位(IU)值。多次对比可保证我们能够排除因测试本身的不稳定性(如产品批次，使用方法和测试方案等的变异性)而导致的异常值的出现。经多次比对得出的结果可对我们产品的国际单位(IU)值进行可靠的定量。


● 为什么收到Peprotech的细胞因子之后，在产品管中看不到任何蛋白团块或粉末状产品？ 

与市场上的许多蛋白产品不同，PeproTech的产品中不含任何载体蛋白和其它添加物（如BSA, HSA和蔗糖等），并且常在最低含盐量的溶液中冻干，结果是微量的蛋白在冻干过程中会沉积在管壁上，形成蛋白薄膜，有时肉眼观察不到。建议在打开管盖前用小离心机快速离心20-30秒，使附着在管盖或管壁上的蛋白聚集于管底。尽管可能看不到蛋白团块，但Peprotech的质控程序保证每管中的蛋白含量准确无误。


● 无动物组分（Animal Free, AF）重组蛋白和普通科研级别（RUO）重组蛋白的区别

无动物组分（AF）的细胞因子或重组蛋白与普通科研级别（RUO）的细胞因子或重组蛋白相比在蛋白生物活性及氨基酸序列上是完全一致的，最主要的区别是在蛋白的表达细胞及表达体系上。无动物组分的细胞因子或蛋白均为原核表达，在传统表达法的基础上对培养体系进行了改进，在培养过程中不加入蛋白胨或牛血清等动物成分，因此最后所得到的细胞因子或蛋白是不含有任何动物成分的。这使得其在使用过程中不会给培养体系引入动物源的病毒，更适用于体内实验，可保证实验结果的稳定性。具体信息请见下表：

Peprotech细胞因子其他常见问题


● 在查找Peprotech细胞因子的过程中，经常有客户会遇到这样的问题，想查找Mouse的某指标产品，但发现官网没有，只能找到人的，例如客户要找Mouse CNTF，却只找到了Human CNTF，此时是否可以使用呢？ 

对于这种情况，建议查看官网产品页面所列出的crossreactivity，如下图所示。在Peprotech官网列出的交叉种属中，如果点击交叉种属可以转入参考文献的界面，是已经有客户将该产品应用于该种属发表了文章的种属，可以将其推荐给客户，并且可以售后，例如点击Mouse，会自动转入参考文献界面（如下图）。但是，如果在交叉种属下面没有文献链接的种属，是指蛋白同源性高才会被列举到交叉反应中，要推荐给客户的话，需要提前咨询一下Peprotech的技术，如果厂家经过比对或者经过核实，确定是可以推荐给客户的，那么这个蛋白是有售后的，否则只能建议客户尝试，但不保售后。

更多详情请联系Peprotech中国代理商上海金畔生物

Bioxcell抗体常见问题

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Bioxcell抗体常见问题

● Bioxcell抗体如何储存？

请将抗体置于4℃避光储存。即使分装后，也不推荐将抗体冷冻储存，因为冻融循环会导致抗体活性降低。一般来说，蛋白在高浓度条件下储存不易降解，因此应避免将抗体稀释至工作浓度后在4℃条件下储存超过一天，即应现用现配。按要求储存且保证抗体无菌，抗体活性可保持长达一年甚至更长时间。


● 收到产品后应如何处理？

收到抗体后，在分装储存及使用时需在生物安全柜中进行，并使用无菌枪头、离心管、注射器和缓冲液等，降低污染率。另外，使用前抗体要处于低温状态。


● Bioxcell产品的保质期是多久？

如果按说明书要求储存产品，BioXCell的产品自收到之日起一年内保持稳定。


● Bioxcell抗体以何种形式提供？

Bioxcell抗体均以无菌PBS缓冲液的形式提供。该溶液中不含稳定剂、防腐剂、载体蛋白、甘油或任何其他添加剂。PBS缓冲液由Na2HPO4、NaH2PO4和NaCl组成，每个成分的具体摩尔浓度由抗体pI值决定，即抗体的pI值决定了PBS缓冲液的pH值。如有特殊要求，Bioxcell可以在其他缓冲液中提供抗体，但不能提供冻干粉末抗体。


● Bioxcell抗体的浓度是多少？

Bioxcell不同批次抗体的浓度不同，但一般来说是在4到10mg/mL之间。包装的离心管上会标记抗体的具体浓度。如果需要在订购之前知道产品的确切浓度，请联系上海金畔生物。


● Bioxcell抗体的氨基酸或DNA序列是什么？

Bioxcell抗体是使用杂交瘤技术生产的，所以抗体的氨基酸或DNA序列是未知的。


● Bioxcell抗体的抗原表位是什么？

BioXcell不提供抗原表位信息，请客户自行参考文献。


● 应如何稀释抗体至工作浓度？

建议使用官网推荐的InVivoPure稀释缓冲液稀释Bioxcell抗体。在没有InVivoPure稀释缓冲液的情况下，可以使用与抗体PBS缓冲液pH相同或相近的的无菌PBS，以避免蛋白聚集。稀释时，建议使用预冷缓冲液，并在生物安全柜中操作，使用无菌枪头、试管、注射器和缓冲液来保持抗体的无菌性。应避免将抗体稀释至工作浓度后在4℃条件下储存超过一天。


● Bioxcell抗体是否适用于体内注射实验？

Bioxcell产品均适用于体内实验研究，它们以PBS的形式提供，不含叠氮化物等防腐剂或BSA等蛋白质稳定剂，内毒素水平< 2EU/mg(InVivoMab)，符合大多数体内研究的条件。为了满足更严格的实验要求，Bioxcell还可提供更低内毒素水平的抗体<1eu>


● Bioxcell抗体在体内的半衰期是多久？

厂家没有抗体在体内的半衰期数据。因为抗体的半衰期是高度可变的，并且受到物种、同型、抗原分布、抗原浓度和许多其他因素的影响。建议阅读感兴趣抗体已发表的相关文献，参考与您实验条件及设计相近的实验数据，预估抗体的半衰期。


● 实验时应多久注射一次？每次注射多少抗体？

实验中很多细节都会影响抗体的最佳使用量及注射频率，例如小鼠品系、疾病模型、实验持续时间、目标组织、抗原浓度等等。因此，客户最好通过阅读相关的参考文献确定最佳使用剂量及注射频率的范围，在此基础上进行优化。建议客户在正式实验之前，先做一个小规模的预实验，以摸索最适的实验条件。注：Bioxcell官网每个产品介绍页下面都会有最新的参考文献供客户参考。


● Bioxcell InVivoMab和InVivoPlus两种级别的抗体有什么区别？

InvovoPlus级别的产品内毒素含量更低，经过多种实验验证，更适合用于体内实验研究，具体区别请见下表：

InVivoMab InVivoPlus
纯度 >95% >95%
蛋白完整性 √(verified via SDS-PAGE) √(verified via SDS-PAGE)
内毒素浓度 <2 eu> <1 eu>
不含叠氮化物和载体蛋白 √ √
是否适用于体内研究 √ √
是否提供大包装 √ √
是否经WB、FC或ELISA验证 √
验证蛋白聚集≤5% √
是否经过鼠科病原体检测 √
产品货号 BE-开头 BP-开头


● 抗体收到后有漂浮物、絮状沉淀或聚集物是否正常？应如何处理？

温度变化、冻融、运输过程中的震动或长期贮藏等环境条件可能会导致蛋白质聚集，这些聚集物可能会沉淀在离心管的底部，或漂浮溶液中，因此收到抗体后有少量的絮状物属于正常现象。可在室温下通过轻微的震动、过滤或离心去除。


● 没注意说明书上的储存要求，将抗体置于室温储存了一段时间，或者抗体过了一年的有效期，是否还可以继续使用？

一般来说，室温下放置几个小时不会影响抗体的活性，但是放置几天或者更长时间则有可能会导致蛋白降解，影响抗体活性。但抗体是否可继续用于后续实验，需进行相关的活性测试。为确认抗体是否降解，最简单的方法是取大约10ug的抗体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。在非还原条件下，如果在抗体分子量位置只有一条条带，则表明抗体未降解，如果蛋白质未通过凝胶迁移，或者有许多其他的条带，则表明抗体已降解。但这个测试只是验证抗体是否降解，不能确认抗体功能是否正常。确认抗体在体内是否起作用的唯一方法是进行小规模的体内测试，以验证抗体功能的完整性。

详情请咨询 BioXcell 中国代理-上海金畔生物科技

Invivogen抗污染抗生素常见问题

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Invivogen抗污染抗生素常见问题

Ø抗污染抗生素

细胞培养过程中如何避免细胞污染？

1 进行细胞培养时确保处于无菌环境，并使用恰当的灭菌技术。

2 细胞培养过程中所使用的培养基或添加的培养物均要确保无菌无污染。

3 定期使用显微镜或检测试剂盒监测细胞培养基，以确保无微生物污染。

4 使用抗污染抗生素。在原代细胞培养或克隆过程中微生物污染是难以发现的，Invivogen公司为此设计了具有预防功能的防污染试剂。Invivogen公司可提供的抗污染抗生素有Plasmocin™ prophylactic，Normocin™， Primocin™ 及Fungin™。

如何鉴别细胞培养过程中被哪种微生物污染？

如果细胞培养过程中存在细菌和/或真菌污染，可以使用光学显微镜进行鉴别。因为它们的生长速度很快，可以使细胞培养基出现浑浊或菌斑，一般48小时后即可用肉眼检测。随后可使用检测试剂盒对这些微生物种类进行鉴定。然而，支原体污染不能直接用肉眼观察，也不能通过光学显微镜进行鉴别，只能通过特有的分析方法（如支原体检测试剂盒）进行检测。因此，在细胞培养过程中支原体污染很容易被忽视。Invivogen提供的PlasmoTest™支原体污染检测试剂盒结果可靠，分析准确，尤其是可以排除假阳性或不确定的结果。

针对不同微生物的污染，应如何选择Invivogen的抗污染抗生素？

应用

产品名称

支原体

细菌

酵母

真菌

规格

产品货号

预防

Plasmocin™ prophylactic

√

*

25mg（10×1 ml）

ant-mpp

Normocin™

√

√

√

√

500 mg（10×1 ml）

ant-nr-1

Primocin™

√

√

√

√

500 mg（10×1 ml）

ant-pm-1

Fungin™

√

√

75 mg（5×1.5 ml vails）

ant-fn-1

检测

PlasmoTest™

√

√

1 kit（250 samples）

rep-pt1

清除

Plasmocin™ Treatment

√

*

500 mg（2×1 ml）

ant-mpt

Plasmocure™

√

*

100 mg（1 ml）

ant-pc

Normocure™

√

100 mg（2×1 ml）

ant-noc

Fungin™

√

√

75 mg（5×1.5 ml vails）

ant-fn-1

在冻存细胞之前的细胞培养过程中，可以添加抗污染抗生素吗？

可以的，在冻存细胞之前可以添加Plasmocin™ prophylactic（预防支原体污染试剂）或广谱抗生素Normocin™。但是，在这之前需使用光学显微镜鉴定细胞是否被细菌或真菌污染，或使用PlasmoTest™支原体检测试剂盒检测是否存在支原体污染。

Invivogen是否可以提供一种可以同时抵抗细菌、真菌、支原体污染的抗生素吗？

Normocin™和Primocin™这两款抗生素是广谱性的，可同时抵御细菌、真菌、支原体的污染。两者的区别是Primocin™推荐用于原代细胞培养中预防微生物的污染，而Normocin™则推荐用于细胞系培养。

在细胞培养过程中可以同时使用Invivogen的抗污染抗生素及基因筛选抗生素吗？抗污染抗生素会影响基因筛选抗生素的作用效果吗？

在细胞培养过程中可同时使用Invivogen的抗污染抗生素及基因筛选抗生素，抗污染抗生素的使用不会干扰常用的基因筛选抗生素的作用效果，例如G418, Blasticidin, Puromycin, Hygromycin B和 Zeocin™。

Ø细菌污染

细胞培养过程中应如何鉴别细菌污染？

由于细菌比真核细胞小很多，因此在细菌污染的早期阶段通常被认为是细胞碎片。这个时候应使用放大倍数为100×-400×的光学显微镜观察细胞培养基的状态。如果观察到黑色斑点、杆状物或螺旋状物，那培养基应该是被细菌污染了。由于细菌生长快速，在污染后的48小时内便可引起培养基的变化，使培养基变浑浊。若培养基中含有酚红，由于细菌的新陈代谢使培养基的pH下降，从而导致培养基的颜色迅速变为黄色。因此在细菌污染48小时之后，便可用肉眼直接观察。微生物污染后的细胞培养基应该弃去，但如果没有其他替代的培养基可用，则可使用Invivogen的Plasmocin™ Treatment, Normocure™或者 Plasmocure™污染物清除试剂。

当在细胞培养过程中不确定具体是哪种细菌污染细胞时，应该选择哪种抗污染抗生素？

当不确定细胞是被哪种细菌污染时，推荐使用对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有效，具有光谱抗性的Normocure™。目前的研究结果表明，Normocure™可有效预防细胞培养过程中的细菌污染，例如葡萄球菌、无色杆菌。


Ø真菌污染

细胞培养过程中应如何鉴别真菌污染？

由于真菌菌丝可用肉眼或光学显微镜观察，因此真菌污染细胞培养基之后可直接通过肉眼或者光学显微镜进行检测。酵母（30-10 um）是形态结构最小的真菌，在光学显微镜下便可被观察到。另外，真菌的生长繁殖会导致培养基中pH值增加，从而使含酚红的培养基呈粉色。在大量真菌污染物存在的情况下，菌落可能形成霉菌，漂浮在培养基表面。此时应立即丢弃培养基，以防孢子传播。

细胞培养过程中为预防或清除真菌污染，Fungin™可以与青霉素、链霉素（Pen-Strep）同时使用吗？

可以的，Fungin™可以与一般的抗生素如青霉素、链霉素一起使用。

Fungin™可以在麦康凯琼脂培养基（MacConkey Agar）和血平板培养基中使用吗？ 

可以的，Fungin™可以在其他培养基，如麦康凯琼脂培养基（MacConkey Agar）和血平板培养基中使用。

已经使用Fungin™处理了7天，但不确定真菌污染是否已全部被清除，对于这个问题有什么建议吗？

Invivogen建议将培养基分成两份，一份继续使用Fungin™继续处理3-4天，另外一份中加入无Fungin™或青霉素-链霉素的新鲜培养基，之后取1 mL至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，将培养皿置于20-25℃ 3-5天。此方法可以帮您确认培养基中的真菌污染物是否已全部被清除。

推荐使用什么浓度的Fungin™处理细胞？

说明书中推荐使用50 ug/mL的Fungin™处理细胞，但Invivogen建议同时做75 ug/mL的平行处理组，以估计去除真菌污染的最佳使用剂量。处理时间应持续5-10天。

Ø支原体污染

如何使用Invivogen的支原体检测试剂盒Plasmo TestTM检测支原体？

PlasmoTest™支原体检测试剂盒是一种基于细胞的比色分析方法，利用Toll样受体II可以识别支原体成分（脂肽）的能力，诱导信号级联反应，导致NF-κB和其他转录因子的激活。在支原体存在的情况下，HEK-Blue™-2细胞表面表达的TLR2会激活这些转录因子，进而诱导分泌sAP（分泌性碱性磷酸酶）报告蛋白，可在16 – 24小时内被HEK-Blue™检测培养基检测到。

Invivogen的支原体检测试剂盒Plasmo TestTM只能检测活的支原体吗？

PlasmoTest™支原体检测试剂盒是通过检测支原体脂蛋白来判断是否有支原体存在的，因此其既可以检测细胞培养基中存在的活的支原体，也可以检测死的支原体。

另外，Invivogen的PlasmoTest™支原体检测试剂盒不仅可以检测支原体的脂蛋白，也可以检测细菌的脂蛋白。但是由于细菌污染可直接通过观察细胞培养基的状态进行鉴定，因此，当PlasmoTest™检测试剂盒结果呈现阳性，且细胞培养基无浑浊、颜色无变化时，可以断定培养基受到了支原体污染。

Invivogen的支原体检测试剂盒Plasmo TestTM与其他支原体检测试剂盒相比，有什么优势吗？

PlasmoTestTM是首款基于细胞分析原理检测细胞培养基中支原体污染的试剂盒，操作者只需具有基本的细胞培养的知识即可进行操作。试剂盒在过夜孵育之后，一小时之内即可获得检测结果。以往常用的支原体检测方法是PCR，但这种检测方法具有明显的缺陷，例如假阴性结果且能够检测的支原体种类受引物限制，无法对全部支原体进行检测。最重要的是，Plasmo TestTM检测结果呈阳性时，即表明细胞培养基中存在支原体污染物，因此不会出现假阳性结果。

在细胞培养过程中使用哪种试剂来预防支原体污染？使用那种试剂清除已污染的支原体？

● Plasmocin™ prophylactic（支原体预防试剂）是专门用于预防支原体污染的，它含有两种有效的杀菌成分，作用于蛋白质合成和DNA复制。

● Plasmocin™ treatment（支原体清除试剂），可在2 – 3周内快速有效地消除支原体污染。如果2-3周之后使用Plasmocin™支原体清除试剂之后无法有效清除支原体污染，或支原体对Plasmocin™产生了耐药性，可使用● Plasmocure™。Plasmocin™ treatment和Plasmocure™均是由两种不同抗生素混合而成，通过不同的机制发挥作用，可使支原体在2 – 3周内彻底清除。

在细胞培养时，可以直接使用Plasmocure™代替Plasmocin™ treatment清除已污染的支原体吗？

Plasmocin™ treatment和 Plasmocure™均是混合抗生素，用于清除已污染支原体。然而，Invivogen推荐只有在支原体对Plasmocin™ treatment产生抗性的情况下才可使用Plasmocure™。

如果支原体对Plasmocure™、Plasmocin™ treatment均已产生抗性，应该怎么办呢？

如果使用Plasmocure™、Plasmocin™ treatment均无法有效清除细胞中的支原体污染物，则表明样本中的支原体污染非常严重。这种情况下最好的办法是在下一次传代时尽可能稀释您的细胞，以此来稀释细胞中的支原体污染物。之后使用不同浓度（确保对细胞不会有太大毒性的浓度）的Plasmocure™再次处理细胞2周，例如使用工作浓度为50 ug/mL和100 ug/mL的Plasmocure™处理细胞。处理2周之后，将细胞分成两份，一份使用Plasmocure™继续处理一周，另一份不添加任何抗生素，3天后使用PlasmoTest™支原体检测试剂盒检测污染情况，以避免出现假阴性结果。如果您的细胞仍存在支原体污染，请重复以上步骤。

以上的操作步骤可有效清除90%的支原体污染，若您样本中的支原体污染物未得到有效清除，请及时联系我们。

Plasmocin™ treatment支原体清除试剂对细胞内的支原体污染有效吗？

Plasmocin™ treatment对胞内、胞外的支原体污染均有效。

我通常在T25细胞培养瓶中清除支原体污染，如果换用6孔板的话，清除效果会更好吗？

在T25细胞培养瓶中清除支原体污染物是合适的。当细胞的汇合度在60-70%及处于传代时期时，支原体的清除效果最佳，因为这可以确保不断去除支原体及添加新鲜的Plasmocin™ treatment或 Plasmocure™支原体清除试剂。

使用Plasmocin™ treatment处理细胞之后，取细胞培养上清进行PCR检测，结果显示支原体污染呈阴性，但几周之后细胞再次受到了支原体污染应如何处理？

非常抱歉，这种情况应该是使用Plasmocin™ treatment期间并未完全清除您样本中的支原体污染物。为防止这种情况再次发生，Invivogen建议在使用Plasmocin™ treatment处理2周之后，将细胞培养基分成两份。一份继续使用Plasmocin™ treatment继续处理1周，以防处理两周后细胞培养基中仍存在微量支原体污染物而发生再次污染的情况。另一份使用不含任何抗生素的培养基培养细胞，3天之后进行支原体检测，以检测使用Plasmocin™ treatment处理2周之后细胞培养基中的支原体残留量。

Plasmocin™ treatment是否适用于清除昆虫细胞内的支原体污染?

Plasmocin™ treatment适用于清除sf9细胞的内的支原体污染，因此应该同样适用于其他昆虫细胞，但是invivogen无将Plasmocin™ treatment用于昆虫细胞的案例及数据。

无菌污染-内毒素污染

什么是无菌污染？这会对细胞培养造成什么问题？

无菌污染物存在于无菌但仍有可能含有细菌成分的溶液和试剂中。内毒素也被称为脂多糖（LPS）或脂聚糖，是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分。内毒素在体内、体外均是有效的验证诱导剂。内毒素污染是细胞培养和药物生产中的主要问题。因此，需格外注意无菌溶液和试剂的使用，检测细胞培养试剂中的内毒素水平是非常重要的。有关内毒素污染的更多信息，请查看细胞培养污染指南。

内毒素污染的常见来源有哪些？

内毒素的来源包括培养基、血清、水、缓冲液和其他细胞培养试剂，如胰蛋白酶。为了避免内毒素污染，我们建议要求制造商提供内毒素水平认证，或在使用这些试剂之前，使用Invivogen的HEK-BlueTM 脂多糖（LPS）检测试剂盒2进行内毒素水平检测。

Invivogen的 HEK-Blue™ 脂多糖（LPS）检测试剂盒如何检测脂多糖（LPS）？

HEK-Blue™ 脂多糖（LPS）检测试剂盒2是一款基于细胞分析的比色试剂盒，专门用于检测具有生物活性的内毒素，可检测低至0.01 EU/mL的微量脂多糖（LPS），其检测原理是基于TLR4可识别革兰氏阴性菌结构上不同LPS的能力。微量（<0.01 EU/mL）脂多糖（LPS）的存在即可导致NF-κB的激活和分泌型碱性磷酸酶（SEAP）的产生。使用HEK-BlueTM进行检测时，NF-κB激活可以用肉眼观察或通过读取OD650进行定量。

您可以在以下文件中找到更多细节：细胞培养污染指南。

HEK-Blue™ 脂多糖（LPS）检测试剂盒2总共可以进行多少次实验？

HEK-Blue™ 脂多糖（LPS）检测试剂盒2提供了1 mL的QB试剂和1 mL的QB缓冲液，这足够制备100 mL的分泌型碱性磷酸酶检测试剂-QUANTI-Blue™溶液，可供大约供5个96孔板（480孔）进行分析。

HEK-Blue™ 脂多糖（LPS）检测试剂盒2的敏感性如何？

HEK-Blue™ 脂多糖（LPS）检测试剂盒2是高敏检测试剂盒，可以检测低至0.01 EU/mL的内毒素。

细胞培养过程中如果要使用HEK-Blue™ 脂多糖（LPS）检测试剂盒2检测内毒素污染状况，是否可以使用胎牛血清培养细胞，如果可以，胎牛血清中的内毒素水平最高可为多少？

由于胎牛血清（FBS）中可能含有内毒素，因此其可能会影响HEK-Blue™-4细胞的功能，进而干扰实验结果。因此如果要使用胎牛血清（FBS），请务必保证无内毒素。因此，我们建议在购买胎牛血清（FBS）之前，请要求供应商提供内毒素水平的认证报告。

拆封之后，HEK-Blue™ 脂多糖（LPS）检测试剂盒2的稳定性如何？

收到HEK-Blue™ 脂多糖（LPS）检测试剂盒2之后，应立即对其中的HEK-Blue™细胞系进行培养繁殖，以冻存细胞。由于细胞可以保存在液氮中，因此细胞没有有效期。至于试剂盒的其他部分，如果按照说明书中的要求正确储存于适当条件下，可稳定1年的时间。

在检测血液样本中的脂多糖（LPS）含量时，如何避免NF-κB激活因子对NF-κB反应的非特异性激活?

有两种方法可以避免NF-κB激活因子对NF-κB反应的非特异性激活：

使用HEK-Blue™ Null1亲本细胞系作为阴性对照。该细胞系只表达NFkB诱导系统（不表达负责LPS识别的TLR4受体），因此，HEK-Blue™ Null1细胞可以检测到任何非特异性的NFkB激活。

您可以使用Invivogen Ultrapure LPS-RS拮抗TLR4反应。如果使用该拮抗剂之后发现信号减弱，就可以确定样本是TLR4特异性激活。该拮抗剂的参考文献如下：LPS-RS ultrapure (#tlrl-prslps)。

Ø Primocin™

Primocin™含有四环素吗？

不含，Primocin™不含四环素。

Primocin™用于预防支原体污染还是清除支原体污染？

PrimocinTM是一种预防性抗生素，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及支原体和真菌均有效。PrimocinTM不能用于清除已经污染的细胞中的微生物。

应如何储存 Primocin™？

Primocin™在室温运输。收到后可在4℃保存3个月，也可在-20℃长期保存，避免反复冻融循环。

具体的有效期在产品标签上。产品拆封后可在-20°C保持稳定1年，期间需避免反复冻融循环。

Ø Normocin™

对于细胞培养来说， Normocin™抗生素是必须要使用的吗？

是的，Normocin™是常用的抗污染抗生素之一，Invivogen所有的细胞系都是用这种抗污染抗生素研发出来的，是实验室中细胞培养的常用抗生素。

Normocin™可以用于杂交瘤细胞培养吗?

是的，Normocin™可以用于杂交瘤细胞培养。

应如何储存Normocin™？

Normocin™在室温运输。收到后可在4℃保存3个月，也可在-20℃长期保存，避免反复冻融循环。

具体的有效期在产品标签上。

产品拆封后可在-20°C保持稳定1年，期间需避免反复冻融循环。在4℃无菌条件下可稳定3个月。

预防性抗生素Normocin™和Plasmocin™的区别是什么？

Normocin™预防性抗生素是对支原体、细菌、真菌均有生物活性，而Plasmocin™预防性抗生素只是特异性预防支原体污染。

细胞培养过程中需要一种广谱性的抗污染抗生素，但是由于实验的特殊性，要求抗生素中不含酚红。请问Normocin™是否含有酚红？如有有的话，是否还有其他可替代的符合我们实验要求的产品？

Normocin™抗生素中含有酚红。如果如果您不能使用含有酚红的添加剂，并且希望使用广谱抗生素/抗真菌/抗支原体药物，您可以使用PrimocinTM作为替代。

Ø NormocureTM

应如何储存NormocureTM？

NormocureTM在室温运输。收到后可在4℃保存3个月，也可在-20℃长期保存，避免反复冻融循环。

具体的有效期在产品标签上。

产品拆封后可在-20°C保持稳定1年，期间需避免反复冻融循环。

Normocure™是否可以清除包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌在内的所有细菌污染？

是的，Normocure™是一种针对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的高效广谱抗污染抗生素。像环境中的葡萄球菌和无色杆菌对细胞培养基造成的污染均可有效被Normocure™清除。

PlasmocinTM Treatment（支原体清除试剂）

当溶解2瓶相同批次的支原体清除试剂时，一瓶澄清透明，而另一瓶有沉淀，且37℃加热或超声处理后，沉淀并未溶解，请问这是正常的吗？为什么会出现这种现象？

沉淀物是冻融之后PlasmocinTM Treatment中两种抗生素之一。因为抗生素在所提供浓度下的溶解度是有限的，因此冻融会使得抗生素在溶液中析出。出现这种情况之后不推荐使用超声进行处理，建议将其置于37℃下加热30分钟至1小时，然后涡旋1-2分钟，这会使沉淀物重悬溶解。PlasmocinTM Treatment在37℃条件下可稳定一周的时间，因此无需担心37℃条件下加热1小时会影响PlasmocinTM Treatment的稳定性及作用效果。另外，您也可以使用无菌水对产品进行1:1稀释。

当使用支原体清除试剂处理细胞时，培养基中是否可以含有庆大霉素或抗真菌试剂？

Invivogen不推荐将PlasmocinTM Treatment和其他抗生素，如庆大霉素及抗真菌试剂一起使用，因为这会影响它的活性。PlasmocinTM Treatment在特定浓度下和对某些类型的细胞会表现出一定的毒性，因此将PlasmocinTM Treatment和其他抗生素一起使用可能会使敏感的细胞系致死。

应如何储存支原体清除试剂？

PlasmocinTM Treatment在室温下运输。收到之后可在4℃稳定1个月，或在-20℃条件下储存更长时间，需注意避免重复冻融循环。

具体的有效期在产品标签上。

产品拆封后可在-20°C保持稳定1年，期间需避免反复冻融循环。

细胞已使用其他支原体去除试剂处理过，但未成功去除支原体污染，现在如果继续使用PlasmocinTM Treatment支原体清除试剂可行吗？

如果可以的话，强烈建议在未使用其他支原体清除试剂的新鲜细胞上使用PlasmocinTM Treatment支原体清除试剂，以确保细胞不会对PlasmocinTM Treatment支原体清除试剂中的任何一种抗生素产生耐药性。

Ø Plasmocure™

应如何储存Plasmocure™？

Plasmocure™支原体清除试剂在室温下运输。收到之后可在4℃稳定1个月，或在-20℃条件下储存更长时间，需注意避免重复冻融循环。

具体的有效期在产品标签上。

产品拆封后可在-20°C保持稳定1年，期间需避免反复冻融循环。在100 mg/mL及无菌条件下，将其储存于4℃可稳定3个月的时间。

Ø Plasmocin™ Prophylactic（支原体预防试剂）

 Plasmocin™ Prophylactic支原体预防试剂的CAS号是多少？

 Plasmocin™ Prophylactic支原体预防试剂没有cas号，因为它是不同抗生素的混合物。

 Plasmocin™ Prophylactic支原体预防试剂中是否存在钙盐？

 Plasmocin™ Prophylactic支原体预防试剂中不含钙盐。

应如何储存 Plasmocin™ Prophylactic支原体预防试剂？

 Plasmocin™ Prophylactic支原体预防试剂在室温下运输，收到之后可在4℃下稳定储存一个月，要想稳定储存更长时间，请置于-20℃条件下储存，请避免反复冻融循环。

具体的有效期在产品标签上。

开封后，可在-20℃条件下稳定一年，期间需避免重复冻融循环。

Ø Fungin™

Fungin™含有两性霉素B吗？

Fungin™不含两性霉素B，与两性霉素B不同，Fungin™是一种高度稳定的化合物，它不需要溶解在有毒的脱氧胆酸盐中。

应如何储存Fungin™ ？

Fungin™ 在室温下运输，收到之后可在4℃下短期储存，要想稳定储存更长时间，请置于-20℃条件下储存，请避免反复冻融循环。

具体的有效期在产品标签上。

开封后，若在-20℃条件下，可稳定一年，期间需避免重复冻融循环。若在10 mg/mL的浓度下置于4℃无菌条件下，可稳定储存3个月。

Ø PlasmoTest™支原体检测试剂盒

PlasmoTest™支原体检测试剂盒可以检测细胞培养中的细菌污染吗？

PlasmoTest™支原体检测原理是基于TLR2的激活，因此它可以检测支原体和细菌污染。但是，支原体污染不能用肉眼检测到，而细菌污染中由于细胞的生长繁殖会导致培养基pH下降，进而导致培养基浑浊及颜色变化，因此可以结合肉眼观察培养基是否出现异常来判断培养基中是否存在支原体污染。

使用PlasmoTest™支原体试剂盒检测之后，应该在哪个波长下读取吸光值？

吸光值的读取可以在620 nm-655 nm波长范围内进行。根据我们对于QUANTI-Blue溶液的分析，对于无法满足620 nm-655 nm波长的读板仪，可以在600-680 nm波长区间内进行吸光值的读取。但是，这样得到的结果可能会存在低饱和度及高背景的问题。

当使用PlasmoTest™支原体试剂盒检测支原体污染时，应该使用多少细胞？

在收集上清液的同时收集细胞是很重要的，因为如果细胞内也存在支原体污染的话，可以同时检测到细胞内的支原体以及上清液中细胞外的支原体。

为什么使用PlasmoTest™支原体试剂盒检测支原体污染时，样本需要加热？

所有样本必须加热以去除上清液血清中可能存在的碱性磷酸酶，因为这可能会干扰检测结果。此外，加热步骤可以消除样本中残留的支原体，以避免污染扩散。

PlasmoTest™支原体试剂盒中提供的阳性对照和阴性对照分别是什么？

由于信息是专有的，所以非常抱歉不能透露任何与对照品相关的信息。但是请放心，阳性对照不是活的支原体。

当使用PlasmoTest™支原体试剂盒时得到了假阳性结果，是否是由于添加了二甲基亚砜（DMSO）, 胎牛血清（FBS）, 胰蛋白酶（Trypsin）或 PBS磷酸缓冲液影响了实验结果？

在研发PlasmoTest™支原体检测试剂盒时，我们已经证明某些胰蛋白酶和血清会诱导TLR2反应。高浓度DMSO（例如小于1/1000的稀释）的使用会对HEK-Blue™细胞产生毒性，进而导致背景值比较高。PBS缓冲液应该不会影响实验结果。建议单独测试培养基作为阴性对照，以免出现假阳性。

当使用PlasmoTest™试剂盒进行支原体检测时，包括阴性对照在内的所有孔均变为蓝色，该如何解释呢？

有3种可能的原因会导致所有的孔变为蓝色：

1 这可能是由于培养基中存在碱性磷酸酶（AP）。为了验证是否存在这种情况，可以进行一个非常简单的测试。只需在200µL的重悬HEK-Blue™检测试剂中添加50µL用于细胞培养的培养基（无细胞）。如果培养基变蓝，则是由于培养基血清中存在碱性磷酸酶（AP）。此时需加热培养基以去除碱性磷酸酶（AP）并重新进行相同的测试。放置相同的“测试”样本应得到阴性结果。

2 如果将培养基加入到HEK-Blue™检测试剂中无反应，则可能是由于HEK-Blue™ -2细胞受到污染导致所有的孔变为蓝色，此时最佳的选择是换用新的细胞。请注意，在此过程中最好使用滤嘴避免细胞污染。

3 还有可能是在测试之前对细胞处理不当导致所有孔变为蓝色。Invivogen提供以下建议以降低背景信号值，避免在刺激细胞之前NF-κB的激活，从而避免出现假阳性结果：

● 使用预热的PBS清洗细胞

● 使用热灭活的胎牛血清（FBS），有些胎牛血清（FBS）虽然无菌，但含有可能激活HEK-Blue™-2细胞的微生物碎片

● 在刺激细胞之前请勿离心

● 请勿使用胰蛋白酶

PlasmoTest™试剂盒中阳性对照和阴性对照的OD值在什么范围内是正常的？

阳性对照的OD630nm在0.9-1.2范围内是正常的，阴性对照的OD630nm需小于0.2.

不小心将要测试的上清液在室温下放置了2天，这会影响检测结果吗？

如果样本本身无菌且置于无菌的室温条件下是不会影响检测结果的。但是如果不能立即检测收集好的上清液，建议您置于-20℃冷冻储存。

当 HEK Blue™-2细胞开始生长汇合之后，推荐使用什么分流比进行分流。

分流比取决于细胞什么时候需要汇合。一般HEK-Blue™ 细胞的增值时间大概是24小时。因此，如果分流比为1:2时，细胞应该在第二天汇合。如果分流比为1:4，则细胞应该在两天后汇合。

在阳性对照及阴性对照试剂瓶中能够看到粉末状的试剂吗？

阳性对照是一种透明的脂质膜，通常很难用肉眼观察。而阴性对照是一种可见的粉末。

PlasmoTest™试剂盒可以检测血清、血浆样本吗？如果可以的话，哪种样本的检测结果会更好一些？

Invivogen只在PlasmoTestTM试剂盒中的HEK-BlueTM-2细胞上测试过几次血浆和血清样本。结果表明，与使用标准样品（在DMEM中）相比，血清样品的敏感性只有一个对数差异。例如，在血清中，我们可以加检测到高达10^4的UFC/ml发酵支原体，而在DMEM中，我们可以检测到10^3的UFC/ml发酵支原体。另一方面，我们发现DMEM和血浆样本之间存在3个对数差异。例如，在血浆中，支原体浓度高达10^6 UFC/ml才可被检测到，而在DMEM中，10^3 UFC/ml的支原体便可被检测到。因此，PlasmoTestTM试剂盒对血清样本的敏感性要高于血浆样本，更建议使用血清样本而非血浆样本。

更多详情请联系InvivoGen中国代理商上海金畔生物

ELISA实验常见问题及解答

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ELISA实验常见问题及解答

阳性对照偏低或低吸光度
原因 解决方案
试剂未平衡至室温 ● 实验开始前，将试剂盒从冰箱取出平衡至室温
检测体积偏小 ● 确保取液时，正确使用移液器
● 检查移液器吸液管道是否阻塞
● 校正移液器
孵育时间过短 ● 使用计时器，准确孵育时间
底物受污染 ● 使用新配制的试剂，重新实验
包装袋中有湿气 ● 检查袋中是否有干燥剂
● 封好未使用的孔条
● 首次开袋时，应标上日期
样本中有抑制剂 ● 叠氮钠会抑制 HRP 酶的活性
洗涤步骤过于剧烈 ● 降低洗涤系统的压力
试剂在使用前未混匀 ● 使用前务必混匀试剂
实验开始前, 微孔变干燥 ● 实验过程勿中断，需连续完成所有实验步骤
未加终止液 ● 加入终止液，增强颜色反应的强度，稳定最终的颜色反应
结合物工作液浓度偏低 ● 准确稀释制备工作液，按说明书建议操作
读数时使用的滤光片不正确 ● 使用 TMB 底物时，450nm 波长下读数，650nm 波长下读取校正读数
标准曲线良好但样本无检测信号
原因 解决方案
样本中无待检物 ● 设置对照，重新实验
样本中其他物质影响或掩盖检测 ● 作适当稀释，降低其他物质干扰或作系列稀释 , 检测回收率
样本中检测物过高 , Hook 效应导致假阴性 ● 适当倍数稀释样本，检测物浓度尽量在检测试剂盒检测范围内
假阳性反应
原因 解决方案
洗涤不充分 ● 使用前须检查洗板机是否正常工作
洗板机管道阻塞 ● 须经常维护洗板机
微孔板受酶结合物污染
加结合物时 , 洒在微孔边缘
结合物污染了底物溶液		 ● 小心向微孔加入结合物，加入微孔底部中央，避免与孔壁和边缘接触
检测样本中含有红细胞 ● 离心
微孔中液体挥发 ● 用封板胶密封反应孔 , 置于湿盒内
结合物工作液浓度过高 ● 按说明书稀释
孵育温度过高 ● 降低温度
重复性较差
原因 解决方案
微孔中有小气泡 ● 用针尖挠破气泡
分液误差 ● 检查分液装置
试剂未混匀 ● 确保充分混匀试剂
洗涤不充分 ● 确保所有微孔都抽吸干净，并及时填满微孔
微孔被吸头划破 ● 洗液或注液时，小心操作
样本中有杂质或沉淀物 ● 使用前须离心
孵育温度不稳定 ● 在温度稳定的孵育箱中进行孵育
使用了用过的封板胶纸 ● 每次须使用新的封板胶纸封闭反应孔
高背景或阴性对照值偏高
原因 解决方案
阴性对照孔被阳性对照或样本污染 ● 洗涤时，勿将洗液溢出板孔外
● 确保洗涤时每个孔都充满缓冲液，洗涤后确保将残余液体从孔中移除
● 在微孔中央吸取样本或试剂时，避免枪头与内壁或边缘接触
● 重新洗涤
抗体非特异性结合 ● 封闭液不适合，更换封闭液
● 预处理微孔以防止抗体非特异性结合
酶结合物浓度过高 ● 检查浓缩酶结合物是否按照说明书要求正确稀释
孵育温度过高 ● 抗体在适当温度下具有最适结合活性，确保孵育在说明书指定温度下进行
缓冲液被污染 ● 准备新的缓冲液，进行灭菌过滤
孵育时间过长 ● 按说明书规定时间孵育，或缩短孵育的时间
底物在使用前曝光 ● 应避光保存于暗处
读板前停留时间过长 ● 加终止液后 3 分钟内读数
读数时使用的滤光片不正确 ● 检查滤光片， TMB 底物推荐在 450nm 下读数
未加入终止液 ● 如底物反应未终止，颜色会继续生成
标准曲线不佳
原因 解决方案
倍比系列稀释标准品时，未混匀 ● 加入标准品和稀释液后，须混匀
过早稀释 ● 在刚要使用时，准备试剂立即加入微孔
洗涤不充分 ● 确保所有微孔都抽吸干净，并及时填满微孔
读数时间超出了显色所需时间 ● 读数时间在说明书推荐的时间内，注意观察颜色变化
体积不正确 ● 校正移液器
移液器使用不当 ● 快速等量地将吸液管中的液体分配到各微孔中，使用校正过的移液器
整块板产生阳性 OD 值或整个板显蓝色
原因 解决方案
洗涤液体积不足或底物被残留于孔低的结合物所污染 ● 洗涤时，缓冲液充满至孔边缘，但要确保不能溢出孔外
结合物浓度过高 ● 检查是否按照说明书推荐比例稀释
血清中有血清因子 ● 勿加热血清
底物容器不洁净 ● 用酸清洗容器瓶，用蒸馏水冲洗
底物孵育时，微孔板曝光 ● 加底物时，立即将板置于暗处
整块板 OD 值偏低
原因 解决方案
显色时间不足 ● 适当延长显色时间
孵育温度偏低 ● 36 度为最适反应温度 ( 金畔 ELISA 试剂盒 )
未加终止液 ● 加入终止液，增强颜色反应的强度，稳定最终的颜色反应
部分原因也可参考【阳性对照偏低或低吸光度】
显色缓慢
原因 解决方案
样本未置于室温 ● 实验开始前，将样本平衡至室温
酶结合物活性减弱 ● 检测稀释度
酶活性受到抑制如叠氮钠 ● 避免使用不当的防腐剂
显色温度不适当 ● 按说明书操作
边缘效应
原因 解决方案
蒸发 ● 各操作步骤间，须使用封板胶密封反应板
温度不均匀 ● 在孵育时，将板放于 36 ℃孵育箱中，避免温度波动。勿叠放反应板防止受热不均

上海金畔生物科技有限公司

PeproGrow™ hESC培养基常见问题

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PeproGrow™ hESC培养基常见问题

1. PeproGrow™ hESC的配方是什么？

PeproGrowTM hESC培养基是PeproTech与美国罗格斯大学干细胞培训中心合作研发的专有配方，不含血清和酚红，化学成分明确。每个PeproGrow™ hESC培养基试剂盒中包含一瓶基础培养基和一管单独的PeproTech重组生长因子冻干粉。

2. 如何储存PeproGrow™ hESC培养基？

基础培养基避光2°C – 8°C最长保存6个月，生长因子冻干粉组分2°C -8°C可保存6个月，-20°C至-80°C则可保存长达5年。

3. PeproGrow™ hESC培养基应该如何使用？

生长因子冻干粉在开盖前需离心，然后根据试剂盒的规格不同用100 µl或500 µl细胞培养级无菌水重悬。如果两周内能用完，则将全部的已重悬生长因子组分无菌操作加入基础培养基中，通过旋转或吹打充分混匀。如果两周内用不完，则需无菌操作取所需体积的基础培养基至一个无菌的聚碳酸酯(PC)瓶或锥形底聚丙烯(PP)管中，然后按比例加入已重悬的生长因子组分，并通过旋转充分混匀。如果整个过程均为无菌操作，配制完成后无需再次过滤除菌。在瓶子标签上标注配制时间及新的有效期(混合后2周)，避光保存于2°C – 8°C。细胞换液前，仅取当次所需量的培养基，复温后使用。

4. 从我目前使用的培养基更换为PeproGrow™ hESC培养基时必须进行适应培养吗？

在两种均含胰岛素的培养基间切换不必进行适应培养，而当从含胰岛素的培养基更换为不含胰岛素的培养基时则可能需要适应培养。是否需要适应培养液也与细胞类型有关。当快速方案(无适应培养)的效果不尽如人意时，额外的适应培养(短期或长期的)可能就有必要了。如果短期的适应培养不奏效时，可使用长期的适应培养，同时逐步提高新培养基的比例，如按100:0，80:20，60:40，20:80和0:100分步进行。请阅读PeproGrow™ hESC培养基使用手册，以获取更多信息。

5. 适应培养过程中出现分化正常吗？

在快速方案和适应培养中出现一些分化都是正常的。您可以刮除分化的克隆，或者挑取未分化的克隆至一个新的包被好的细胞培养皿上继续培养。请阅读PeproGrow™ hESC培养基使用手册，以获取更多信息。

6. 更换为PeproGrow™ hESC培养基后，我的细胞会发生改变吗？

尽管无法精确地预估细胞可能发生的变化，但在使用PeproGrowTM hESC培养基时克隆形态在可能会发生一些改变，比如细胞变得扁平等，但未观察到过细胞多能性和细胞表型的变化。在适应培养过程中，细胞可能会变得更加健壮，更能耐受传代所带来的损伤。请阅读PeproGrowTM hESC培养基使用手册，以获取更多信息。如果使用实验室常规的方法培养未发现细胞改变，则无需改变培养方法。

7. 细胞应在包被的还是未包被的培养器皿中培养？

不建议在未包被的塑料器皿中培养细胞。在适应培养的初始阶段，推荐用Corning Matrigel™包板，后面可使用其它合适的细胞外基质(ECM)。PeproTech为自己的干细胞培养基特制了一款包板试剂，即无动物成分的重组人Vitronectin(玻连蛋白)基质和缓冲液试剂盒(产品编号：AF-VMB-220)。该试剂可直接包板使用，也可与细胞预混后加入培养器皿。

8. 酶消化法传代后，细胞为什么贴壁不好？

原因最有可能是消化过度了。然而，消化后如仍有贴壁的克隆，可继续常规换液。4-6天后，有些细胞会茁壮长出，从其中挑选出2-4个克隆即可将您的培养维持下去。为避免过度消化，您可使用非酶消化法传代。注意：用无动物成分的重组人Vitronectin基质包板时，不能用酶消化法传代，此时应用仅含有PBS, HEPES和EDTA的等渗细胞传代/非酶法消化液(产品编号：CPD-125)来传代。

9. 酶消化传代后如果细胞贴壁不好，有什么改善的方法吗？

研究发现，添加2-10 µM(2 µM最佳)的Y-27632或ROCK抑制剂，可显著改善酶消化法(使用Dispase(分散酶)或Accutase™)传代后细胞的存活及贴壁情况。而过量的Y-27632除能引起可逆的形态学改变外，还可导致神经分化。

10. 关于细胞传代，还有其它建议吗？

下面是我们的一些建议，您也可以参阅PeproGrow™ hESC培养基使用手册。

确定合适的消化时间是细胞传代过程中至关重要的一步。使用Dispase酶消化时一定要避免过度消化，因为过度消化会造成克隆不贴壁或贴壁时发生自身折叠。

培养5-7天后，克隆很可能会长至足够大，此时可以传代。

出现一些细胞死亡是正常的。用Dispase酶法传代后，一定比例的细胞会不贴壁。但如果活细胞比例低于50%，则说明消化过头了。PBS/EDTA法传代则更为温和，正确操作时会有很好的克隆回收率。

11. 对于细胞传代的时机，你们还有什么建议？

传代时机很关键，如果传代过早，细胞会因克隆过小而铺板能力较差，且传代后不易存活。避免胶原酶的过度消化也极为重要。我们推荐使用Disapase酶或PBS/EDTA法，均是消化5分钟最佳，但在消化3分钟时需镜下观察细胞状态，以确定是否用满5分钟。

12. 细胞密度对克隆生长有什么影响？

细胞过疏或过密，均易引起自身分化。如传代比例过高，细胞将无足够的自分泌因子来提高其活力，许多细胞会死亡和/或分化，因此我们建议培养皿中的细胞在接近融合时传代。使用Dispase酶法传代时，可尝试1:6、1:12或1:18的传代比；而用PBS/EDTA法传代时，则可尝试1:6、1:12、1:18或1:24的传代比。如果需要，可进一步提高传代比。当使用Dispase酶法且细胞接种密度较低时，我们建议在传代时添加Y27632，如采用PBS/EDTA法，则无需添加。

13. 细胞铺板时需注意些什么？

我们建议沿着孔的边缘(仅针对六孔板)接种细胞，并轻轻地来回晃动培养板，使细胞混合均匀。如果使用其它规格的培养器皿，加细胞时可通过移动枪头来分散细胞。

14. 对于换液，有什么特别的建议吗？

每天换液。特殊情况下，可通过一次“双倍换液”来度过周末。

15. 我能用以上推荐的基质以外的基质来包被细胞培养器皿吗？

可以的。我们测试过几种其它的包板基质，包括Laminin/Entactin(BD™)，重组人Vitronectin(PeproTech；产品编号为140-09和AF-140-09)和Synthemax II® (Corning)。在标准的细胞培养塑料器皿上，以Laminin/Entactin作为包被基质，细胞生长状态可以达到与Corning Matrigel™近乎一致的水平。而以人Vitronectin和Synthemax II®作为包被基质时，则推荐使用CellBIND®或其它同等类型的细胞培养塑料器皿，才可达到最佳的包被效果。克隆的延展性和贴壁能力弱时有发生，此时需添加Y-27632处理一段时间。

详情请咨询PeproTech代理商–上海金畔生物