ImmPRESS 通用检测试剂在双抗原染色中的应用

对同一张组织切片上的两种或多种抗原进行免疫组化定位，有多种酶学方法可供选择。概括起来可分为两大类： 
用相同的酶系统、不同的酶作用底物对每种抗原进行检测，或用不同的酶系统及其相应的底物，对每种抗原进行检测。 
目前Vector公司所提供的可广泛选择的VECTORSTAIN® ABC kit试剂盒及底物试剂盒，上述两种方法都适用。 
Vector开发的许多独特的底物尤其适用于多抗原标记。通常，过氧化物酶底物能产生更稳定、更密集的有色沉积物而能对抗原进行精确定位；碱性磷酸酶底物较弥散；葡萄糖氧化酶相比而言灵敏度较低，但当使用高浓度的一抗时，也可作为第二种标记对抗原进行定位。 

双抗原染色流程图 

双抗原染色实验步骤 

1.组织标本制备。脱蜡、水化、抗原修复（可根据一抗说明书推荐方法进行操作）。 
2.在蒸馏水中清洗5分钟。 
3.如存在内源酶活性，可采用适当方法以消除内源酶的作用。（如3％H2O2-甲醇液中浸泡10分钟，以消除内源性过氧化氢酶的作用）。 
4.用PBS洗2 分钟/次×3次（也可使用其他缓冲液）。 
5.Avidin/biotin封闭。 如有需要，可进行Avidin/Biotin封闭（Avidin/Biotin 封闭试剂盒，目录号 SP-2001）。在Avidin溶液中孵育15分钟。用缓冲液清洗，然后在Biotin 溶液孵育15分钟。用PBS洗2 分钟/次×3次。如已设置适当对照，背景不需考虑时，也可省去此步。 
6.蛋白封闭。用含5%正常血清的缓冲液孵育20分钟。或在10%的正常血清中孵育5-10分钟。 
7.一抗。甩去多余封闭液，滴加适当浓度的一抗（5%正常血清稀释– VECTASTAIN® kit），室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。在蒸馏水中清洗5分钟。 
8.PBS洗2 分钟/次×3次。 
9.二抗。滴加生物素化二抗，孵育30分钟。若孵育5-10分钟，需升高生物素化二抗的浓度。 
10.PBS洗2 分钟/次×3次。 
11.加入ABC复合物（预先制备的VECTASTAIN® ABC试剂）。孵育30分钟。若孵育5-10分钟，需提高试剂浓度。 
12.PBS洗2 分钟/次×3次。 
13.底物。用适当的酶底物进行孵育（可在显微镜下观察至显色最佳）。请根据底物试剂盒中推荐的时间做参考。 
14.PBS洗2 分钟/次×3次。 
15.（此步起，为对第2种抗原进行染色标记）Avidin/biotin封闭。此步可防止第2套标记试剂与第1套标记试剂相互作用。在蒸馏水中清洗5分钟。 
16.蛋白封闭。用含5%正常血清的缓冲液孵育20分钟。或在10%的正常血清中孵育5-10分钟。用PBS洗2 分钟/次×3次（也可使用其他缓冲液）。 
17.一抗。甩去多余封闭液，滴加适当浓度的一抗（5%正常血清稀释– VECTASTAIN® kit），室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（或适当孵育时间）。 
18.PBS洗2 分钟/次×3次。 
19.二抗。滴加生物素化二抗，孵育30分钟。若孵育5-10分钟，需升高生物素化二抗的浓度。 

20.加入ABC复合物（根据说明书预先制备的VECTASTAIN® ABC试剂）。孵育30分钟。若孵育5-10分钟，需提高试剂浓度。 

21.PBS洗2 分钟/次×3次。 
22.底物。用适当的第2种酶底物进行孵育（可在显微镜下观察至显色最佳）。请根据底物试剂盒中推荐的时间做参考。 23.用自来水冲洗5分钟。 
24.复染、盐酸酒精分化、封片、镜下观察。

优质免疫化学检测酶底物 
       Vector公司能提供过氧化物酶底物、碱性磷酸酶底物和葡萄糖氧化酶底物，以及DuoLuX 化学发光或荧光底物。可用于碱性磷酸酶，过氧化物酶和葡萄糖氧化酶。均为浓缩型，试剂盒内包括能配置成300ml工作液所需的所有试剂成分，足以染色3000-6000张片。试剂盒成分稳定，4℃可保存一年。酶底物反应物有可溶性和非可溶性，适合IHC、WB、ISH、ELISA等多种免疫化学检测方法。

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ImmPRESS 检测试剂盒及其在双抗原染色中的应用

上世纪60年代初，人们发现生物素(biotin)与卵白素(avidin)之间具有高度亲和力，是自然界中具有最强亲和力的物质之一。到了70年代人们又发现生物素可以和抗体交联，且生物素或卵白素与过氧化物酶或荧光素结合后，并不影响它们的生物学活性。从此免疫组化方法进入生物素–卵白素检测系统时代，其代表如ABC、SP等检测系统，时至今日，它们仍被广泛应用。ABC方法是美国VECTOR公司最早推出的经典产品，它利用生物素和卵白素具有极高的亲和性这一生物学特征，将卵白素和生物素化辣根过氧化物酶按照一定的比例混合，形成ABC复合物(卵白素–生物素–过氧化物酶)。在生物素化的二抗结合一抗后，即可与上述ABC复合物形成抗原–抗体–生物素化二抗-ABC，最后用相应的底物显色。此种方法已经沿用了几十年，得到普遍认可，物美价廉，背景干净，但缺点是操作比较麻烦，灵敏度没有不及目前一些新的检测系统高。 
       ABC检测系统的优势在于可以将抗原抗体结合位点的信号进行多级放大，使得多种抗体可以应用于石蜡切片的检测。但是这种检测系统方法也存在缺陷，除了复杂耗时，难以标准化、对某些抗体检出率差以外，最大的问题可能是难以避免内源性生物素的干扰，造成非特异性背景染色，尤其在人体组织中，肝、肾等组织都有较多的内源性生物素，加上目前通用的抗原修复方法可以激活内源性生物素，非特异性背景染色在某些组织的免疫组化染色中不能满足研究的需要。 
       为了克服这一缺陷，人们想出了多种方法。其中最为巧妙的一种方法是用高分子葡聚糖作为载体将多个二抗分子和酶结合在一起，使得检测变得更简单。Vector公司的ImmPRESS系列产品就是将二抗分子和酶通过高分子葡聚糖聚合在一起而成，可以满足研究人员更高的需求。
      Vector生产的ImmPRESS Universal检测试剂盒适合于一抗来源于小鼠和兔的免疫化学染色。试剂盒成分包括：50ml2.5%正常马封闭血清；50 ml 即用型 ImmPRESS（聚合酶–抗体）试剂。