T细胞活化和CAR-T扩增

CAR-T细胞免疫疗法的功效取决于T细胞的增殖的能力和过继后CAR-T细胞能否在体内持续存在。IL-2可以激活和扩增T细胞，是T细胞体外培养最常用的细胞因子；IL-7 和 IL-15 能够增强记忆性干细胞样T细胞（Tscm）和中枢性记忆T细胞（Tcm）的存活和增殖，共表达IL-7可以延长CAR-T细胞的存活时间并提高其扩增能力和杀伤肿瘤的能力。

Peprotech 细胞因子

美国PeproTech公司是全球最大的无动物成分重组蛋白和细胞因子生产商，现可提供100多种重组人、小鼠和大鼠的无动物成分级别蛋白和细胞因子。无动物成分(Animal Free)细胞因子不含任何动物成分，不会给培养体系引入动物源性病原体，非常适合临床用的细胞培养，如免疫细胞治疗、干细胞治疗和组织工程产品等的生产。

此外，PeproTech还可提供GMP级别的PeproGMP®细胞因子，PeproGMP®细胞因子均为无动物成分的，符合美国FDA的GMP规范以及ISO 9001质量管理体系标准，生产过程中不使用任何动物源性原材料。

CD3和CD28 激发型抗体

T细胞体外活化最常用的是CD3抗体和CD28抗体。CD3单克隆抗体（OKT3）能够特异性识别T细胞表面的CD3分子，通过T细胞表面TCR-CD3复合物与抗原提呈细胞表面MHC-II类分子-抗原肽的结合，导致T细胞活化、增殖。激动型CD28抗体对天然CD28受体的刺激可以进一步促进T细胞的活化。

美国BioXcell公司通过大规模的组织培养生产抗体，亲和层析法纯化抗体，所有抗体均具有高纯度、低内毒素，无防腐剂和稳定剂的特性，非常适用于体内临床前研究。BioXcell抗体可提供100mg甚至50g的大包装，性价比非常高。

SAFIRE(Sodium Azide Free Immensely Reduced Endotoxins)类产品是BioGems品牌下的功能性抗体产品，经特殊工艺生产、纯化，不含有叠氮钠，可用于免疫细胞功能的激活、阻断、中和研究，适用于体内实验。

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CAR结构详述

胞外结构域 (细胞外部分):

信号肽：信号肽的作用是引导新形成的工程化蛋白进入内质网。信号肽在细胞表面从工程化受体中切除。

抗原识别区：工程化抗原识别元件由嵌合蛋白，即单链抗体(scFv)构成，其来源于抗体中与靶蛋白特异性结合的部分。可识别与人类白细胞抗原(human leukocyte antigen , HLA)无关的抗原。CAR-T细胞的胞外识别结构域通过特异性识别靶抗原而实现靶向功能，scFv的特异性是影响CAR-T细胞安全性的关键因素。因此，应十分谨慎地选择靶向抗体，以使CAR-T细胞的非特异性结合或脱靶效应降至最低。

铰链：铰链(或间隔区)的作用是将scFv连接到跨膜结构域，并使ScFv的抗原结合部位与T细胞膜分离开来。该序列通常取自各亚型IgG、IgD和CD8的铰链区。铰链决定了scFv与细胞膜和表位依赖性靶点的距离，同时也决定了scFv的灵活性，后者会影响CAR-T细胞的性能。

跨膜结构域:

跨膜(transmembrane,TM)结构域是CARs能在细胞表面正确表达的关键。多种TM序列可满足此要求，如CD3ζ, CD4, CD8和CD28的TM结构域。使用不同TM结构域，CAR的表达量不尽相同。有证据表明，当使用CD28的TM结构域时CAR的表达量较高。

胞内信号结构域(细胞内部分):

CAR的胞内信号结构域对CAR-T细胞的活化、存续和效应功能至关重要。

随着CAR-T细胞研究的不断深入，胞内结构域的组成也在不断优化，以提高其效能。

第一代CAR-T细胞的胞内结构域仅由CD3ζ链组成，CD3ζ链能够产生CAR-T细胞活化所需的第一信号。然而，第一代CAR-T细胞无法产生用于放大活化信号所需的足量IL-2，因此必须额外添加。为了促进IL-2的产生，人们将多种共刺激受体，如CD28、4-1BB(CD137)和OX40(CD134)等的部分序列添加到CAR-T胞内结构域的尾部，开发出双信号CARs，即 ‘第二代CARs’。

第三代CARs在第二代CARs的基础上增加了一个共刺激区，因此包含三个信号结构域，如CD3ζ-CD28-4-1BB或CD3ζ-CD28-OX40。

第四代CAR是在第二代CAR的胞内信号结构域的基础上添加一个IL-12盒，当CAR-T细胞与靶抗原结合后会促进IL-12的分泌。这种含第四代CAR的T细胞被称为“TRUCKs(Tcells directed for universal cytokine killing)细胞”，可在被激活的同时，分泌IL-12。

胞内共刺激结构域的差异直接影响CAR-T细胞的安全性、活性、扩增能力、细胞毒作用以及输注患者体内后的续存时间等。

（图：CAR的结构演化）

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CAR-T细胞基因转导

转染试剂

稳定转染是效应T细胞稳定表达CAR的前提。目前用于CAR-T的基因转导的方法主要有逆转录病毒转导、慢病毒转导和mRNA转染。

Mirus公司的TransIT-VirusGEN®转染试剂可提高载体转染到贴壁或悬浮HEK 293细胞的效率，并有效提高重组腺相关病毒和慢病毒的产量。除了科研级别，Mirus还推出了临床前级别的TransIT-VirusGEN® SELECT Transfection Reagent。TransIT-VirusGEN®SELECT转染试剂优于PEI和PEIpro®试剂，是临床前和早期临床试验中大规模病毒生产的理想选择。Mirus也计划推出GMP级别的TransIT-VirusGEN®转染试剂。

产品优势：

高效 — 实现高滴度病毒大规模生产中DNA高效转染

验证 — 经测试确认配方特性，无菌、低内毒素水平、无支原体

灵活 — 可与不同的重组病毒平台和细胞培养系统兼容

安全 — 完全合成的配方，无动物来源成分

分别使用T ® ransIT-VirusGEN SELECT Transfection Reagent ® (3:1, vol:wt), 25 kDa PEI (4:1, Polysciences) 和 PEIpro (2:1, Polyplus Transfection)将第三代载体pLKO.1-puro-CMVTurboGFP™和ViraSafe™ Pantropic Packaging mix (pRSV-Rev, pCMV-VSV-G, pCgpV, Cell Bio Labs)( 3:0.5:0.5:2 DNA ratio, 1 μg/ml total plasmid DNA)转染至FreeStyle™ F17培养基中悬浮培养的FreeStyle™ 293-F细胞(A)和DMEM + 10% FBS中培养的贴壁293T/17细胞(C)生产慢病毒。用含病毒的上清液转导293T/17细胞，并在转导 ® 72小时后用Guava Easycyte™ 5HT流式细胞仪检测GFP表达情况。

分别使用T ® ransIT-VirusGEN SELECT Transfection Reagent ® (2:1, vol:wt), 25 kDa PEI (2:1, Polysciences) 和 PEIpro (2:1 or 4:1, Polyplus Transfection)将pAAV-hrGFP, pAAV-RC和 pAAV Helper plasmids (1:1:1 DNA ratio, 1.5 μg/ml plasmid DNA, Agilent Technologies)转染 至FreeStyle™ F17培养基中悬浮培养的FreeStyle™ 293-F细胞(B)及DMEM + 10% FBS中培养的贴壁293T/17细胞(D)生产腺相关病毒2型(AAV2)。用收集的病毒转导HT ® 1080细胞，转导48h后用Guava easyCyte™ 5HT流式细胞仪检测GFP表达情况。慢病毒和AAV的功能滴度都是根据GFP阳性细胞少于20%的病毒稀释度计算的。

TransIT-VirusGEN SELECT在悬浮和贴壁细胞培养系统中优于25 kDa线性PEI和PEIpro 转染试剂

美国品牌Cellbiolabs可提供一系列用于病毒表达、病毒包装、病毒浓缩和纯化、病毒滴度检测的研究工具。

病毒纯化试剂盒

病毒滴度检测试剂盒

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CAR-T细胞研究

CAR-T细胞研究

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CAR-T质量检测

ELISA技术常用来评估CAR-T细胞对靶细胞的杀伤活性和特异性以及对细胞因子风暴的监控。金畔QuantiCyto® ELISA试剂盒，品质卓越，行业领先，在国内众多重点实验室广泛使用，深受广大科研人员的好评。金畔ELISA试剂盒自推出以来已多次被Nature, PNAS, Cell research等国际权威期刊引用，4次被Nature期刊引用。

ELISA 试剂盒

每种指标均可提供48T/96T/2*96T/5*96T/10*96T的规格

此外，金畔还提供多因子检测服务，可同时对几十种细胞因子进行定量检测。

ELISpot 试剂盒

在CAR-T细胞治疗中需要对免疫细胞分泌细胞因子的能力进行检测，以判断细胞活化的程度。ELISpot技术由于其高灵敏度、高可信度、高通量、单细胞水平与低成本等优势，已成为科研、治疗和诊断领域T细胞分析的上乘之选，并在CAR-T治疗中受到特别的重视。瑞典品牌Mabtech是ELISpot和T细胞检测技术的全球领先者。Mabtech公司以前沿科学研究和临床大规模筛选需求为向导，不断开发和生产出高质量的ELISpot试剂盒。

Mabtech可提供以下三种形式的ELISpot试剂盒

Lucia 荧光素酶报告T淋巴细胞

InvivoGen可提供用于CAR筛选的NFAT诱导的Lucia荧光素酶报告细胞系，Jurkat T细胞易操作，易转染，

可提升筛选速率。

四聚体和五聚体

CAR的表达水平可以通过流式细胞术检测CAR阳性T细胞的百分比来评价。Proimmune可提供用于检测和分离仅占淋巴细胞0.02%的稀少抗原特异性CD8+ T细胞群的Pro5® MHC Class I五聚体和用于检测抗原特异性CD4+ T细胞的ProT2® MHC Class II四聚体，以及定制服务。

支原体检测试剂盒和内毒素检测试剂盒

PlasmoTest™提供一种快速、简便、可靠的可视化方法检测细胞培养中的支原体污染，该方法首次使用细胞检测支原体。PlasmoTest™试剂盒中的支原体感受器细胞是通过病原体受体——Toll样受体2（TLR2）来检测支原体。在支原体存在的情况下，TLR2启动下游信号通路，活化NF-kB和一些其他的转录因子，这些转录因子诱导SEAP（分泌型胚胎碱性磷酸酶）分泌到上清中，SEAP可以引起HEK-Blue™Detection培养基的颜色变为紫色或蓝色。该方法无假阳性结果，出现颜色变化的阳性结果即可判定为细胞污染。

HEK-Blue™ LPS检测试剂盒基于TLR4识别革兰氏阴性菌中结构不同的LPS，尤其是毒性部分脂质A的能力，设计成对LPS极其敏感的专有细胞——HEK-Blue™-4细胞，是这种内毒素检测试剂盒的主要特征。HEK-Blue™-4细胞检测到低浓度LPS的存在，起始浓度低至0.03ng/ml，都可以导致NK-κB活化。HEK-Blue™ LPS检测试剂盒操作简便，灵敏度高，可检测到0.01 EU/ml的内毒素含量。

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CAR-T细胞简介

CAR-T细胞，即嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor, CAR)-T细胞，是通过基因工程方法在T细胞上表达受体，从而使T细胞靶向肿瘤细胞表面特异性蛋白，并杀伤肿瘤细胞。

CAR-T 细胞包含三个不同的结构域:

胞外结构域:

胞外结构域由三部分组成：信号肽、抗原识别区和间隔区。胞外结构域位于胞浆外侧，与细胞外空间相互作用，负责启动CAR-T细胞的免疫应答。

跨膜结构域:

跨膜结构域具有疏水性，其α-螺旋结构能够保持CAR-T细胞受体的稳定性。

胞内结构域: 

胞内结构域主要由CD3 ζ链胞质区的三个免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs)和共刺激信号区域组成。胞内结构域负责细胞内活化信号的传递。

当CAR-T细胞表面的工程化受体与其它细胞表面的靶蛋白结合时，其胞内结构域发生聚集并在CAR-T细胞内部传递活化信号。随后，活化信号将触发CAR-T细胞对靶细胞的效应功能，导致靶细胞被破坏。

这种基因工程改造的肿瘤特异性T细胞的优点之一是：它们能以MHC非限制性方式对抗原作出应答，避免了因MHC下调导致的肿瘤逃逸。

此外，与传统的T细胞受体(TCRs)不同，基于单链可变区(single-chain variable fragment, scFv)的嵌合受体可以靶向更多种类的抗原，包括如糖类肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens, TAAs)等非经典的T细胞靶点。

目前，CAR-T细胞治疗在B细胞恶性肿瘤中的研究最为全面，在临床上显现出对复发性难治性儿童急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)显著的治疗效果，治愈率可达69%-90%。

迄今为止，仅Kymriah(Novartis) 和 Yescarta(Kite Pharma) 两种CAR-T细胞疗法获得FDA批准。然而，目前已有380多个基于CAR-T细胞的临床试验正在进行中，更多CAR-T细胞疗法获得批准指日可待。

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