DC 细胞的制备方法

DC 是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC 是由2011 年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家Ralph M. Steinman 于1973 年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC 是唯一能够显著刺激初始T 细胞(Naïve T cells)增殖的APC，而其它种类的APC(如单核巨噬细胞，B 细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T 细胞，因此DC 是机体适应性T 细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中发挥着极其重要的作用。

【培养原理】

因为 DC 需从其它种类细胞诱导分化而来，且可分为不同的成熟阶段，所以通常分为2个步骤进行培养：

Step 1：从DC 的祖细胞(如单核细胞)诱导分化为未成熟DC (immature DC，iDC)；

Step 2：从iDC 诱导分化为成熟DC (mature DC，mDC)。

Step 1 需要试剂：

GM-CSF 和IL-4 共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC，此时的DC 具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I 类、II 类分子和B7 家族分子(CD80, CD86 等)，但不表达或低表达CD14。

GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)：

GM-CSF 是最早被鉴定出对DC 培养有作用的细胞因子之一，在DC 培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II 类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF 也可促进DC 的存活。

IL-4 (白细胞介素-4)

IL-4 在由单核细胞诱导成DC 的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC 方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4 还有降低细胞表面表达CD14 分子的能力。CD14 表达水平的降低是单核细胞分化为DC 的重要标志。

Step 2 需要试剂：

TNF-a/IL-1b/ IL-6 (肿瘤坏死因子–a/白细胞介素-1b/白细胞介素-6)

TNF-a，IL-1b和IL-6 均为促炎症因子，在感染局部和肿瘤部位被诱导产生。体外研究表明，这3 种细胞因子均可下调未成熟DC 的巨胞饮作用和表面Fc 受体的表达，使细胞内MHC II 类分子区室(class II compartment)消失，但能够上调细胞表面MHC I 类、II 类分子和B7 家族分子(CD80, CD86 等)的表达， 使未成熟DC 分化为成熟DC，此时DC 的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强地激活T细胞。TNF-a/IL-1b/IL-6 三因子组合可在无牛血清培养条件下诱导DC 的完全成熟，从而制备出可以应用于临床的DC。

PGE2 (prostaglandin E2，前列腺素E2)

PGE2 也是炎性介质，可由TNF-a，IL-1 和LPS(脂多糖)等炎症信号诱导产生。在TNF-a/IL-1b/IL-6 成熟诱导组合中添加PGE2，可进一步提高DC 的产量、成熟度、迁移能力和免疫激活能力。这里尤为重要的是DC 迁移能力的提高。因为TNF-a/IL-1b/IL-6 诱导成熟的DC 迁移能力较弱，不能很好地到达淋巴结而激活T 细胞。而添加PGE2 后诱导成熟的DC 因表面趋化因子受体的高表达，而更容易迁移至淋巴结，而引起机体对抗肿瘤的免疫反应。因此，TNF-a/IL-1b/IL-6/PGE2 组合(见下表)广泛应用于临床，并被认为是制备成熟DC 的“金标准”

组份 的工作浓度

TNF-a  10ng/ml   IL-1b    10ng/ml   IL-6   1000 U/ml   PGE2  1mg/ml

【DC 培养试剂推荐】

注：Animal Free 意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动物源性物质，尤其是牛的病原体和蛋白的混入，使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病原体(如疯牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞培养过程中最好使用无动物成分的重组细胞因子。

【DC 鉴定试剂推荐】

注：用于DC 鉴定的表面标志物的表达在流式图上均呈现单个峰，且多数情况下不能与阴性峰完全区分开来。为避免多色分析时补偿调节不好导致结果的不准确性，建议最好用单标，最多用双标来做DC 表面标志的分析，而且必须使用同型对照，而非空白细胞对照来排除背景染色。

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