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困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian酶试剂盒Takara Clontech

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困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian
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Clontech 635005 SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit – Pico Input Mammalian(库存销售完毕即终卖) 12 Rxns ￥16,311 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
Clontech 635006 SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit – Pico Input Mammalian(库存销售完毕即终卖) 48 Rxns ￥47,874 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
Clontech 634411 SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian 12 Rxns ￥13,396 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
Clontech 634412 SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian 48 Rxns ￥45,546 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
Clontech 634413 SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian 96 Rxns ￥59,918 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
Clontech 634414 SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian 192 Rxns ￥107,811 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian 困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
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SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input
Mammalian以皮克级总RNA构建Illumina链特性RNA-seq文库
· 皮克级样品起始—可以250 pg-10 ng人，小鼠或大鼠总RNA起始
· 用途广泛—可以不同品质RNA（包括FFPE/LCM样品及游离RNA）制备文库，获得高重复再现数据
· 性能提升-不增加PhiX也可获得较高的簇通过过滤百分比（FP%），识别更多转录本，重复更少
· 保留链来源信息—转录本链来源信息识别准确度高
· 快速，一体化流程—整体流程只需~6 h ，改良了buffer配方，缩短了文库纯化时间
· 无缝衔接Illumina测序—直接制备多达96种index的 Illumina®-ready文库
 
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian设计用于从皮克级总RNA(250 pg–10 ng)中高效制备Illumina测序文库。本试剂中采用的技术适用于高品质，部分降解及低品质RNA（如来自于FFPE或LCM样品）。本试剂是一体化操作流程，保留了链来源信息，并且不需要下游文库制备，在反转录和PCR扩增过程中就可以添加indexes和接头。升级产品与原有SMARTer 皮克级产品相比，提升了在所有Illumina测序平台的测序性能，并且文库纯化操作更加方便。
核糖体RNA在总RNA中占有很高的比重（~90%）。在制备文库前从总RNA中去除掉这些大量的RNA，有利于降低测序成本，提高统计数据的比对比率。但是在以微量样品起始时，如果一开始就从总RNA中去除rRNA，会造成纯化后的起始样品太少而不能制备高品质测序文库，本试剂采用专有的特异针对哺乳动物rRNA和部分线粒体RNA的探针去除核糖体cDNA（来源于核糖体RNA的cDNA片段）。采用本试剂制备的文库与前代试剂制备的文库接头配置不同，即使是使用基于双通道SBS技术的Illumina平台如NextSeq®， MiniSeq™， 和 HiSeq® 3000/4000测序时，不需要添加大量PhiX也可以获得高比例的簇通过过滤百分比(%PF)。每个run可以获得更多的生物学相关测序reads，这又反过来减少了测序成本。采用Pico v2 Kit同样可以获得更多的特异转录本，更低的rRNA、mtRNA比对率和重复率。此外，Pico v2 Kit包含了一种新的PCR buffer，提高了文库纯化效率。
试剂盒提供12，48，96和192次反应规格。高通量版本试剂 (Code No. 634413,634414) 包含12种反向引物，8种正向引物，最多可以构建96种indexes文库。包括文库构建及纯化的整体流程只需~6 h。
 
不同样品起始量解决方案：
· 10-100 ng 总RNA, 推荐使用 SMARTer Stranded Total RNA Sample Prep Kit – Low Input Mammalian
· 100 ng-1 μg总RNA, 推荐使用SMARTer Stranded Total RNA Sample Prep Kit – HI Mammalian
 
困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
图1. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian技术流程
 
困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
图2. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian提高了通过过滤百分比（FP%）。如图所示，分别采用Pico v1 或Pico v2制备文库并使用NextSeq 500 或 MiniSeq平台测序。图中，蓝色图框表示未过滤（原始）reads的簇密度分布，绿色图框表示通过过滤reads的簇密度分布。 图中显示了通过过滤的reads数（以百万计）和每个run的%PF。
 
困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
图3. 新的SeqAmp CB PCR buffer利于磁珠-沉淀物形成。Pico v2中的PCR buffer经过重新设计可以更快、更紧密的形成磁珠-沉淀物。经过磁力分离后，在新的SeqAmp CB buffer（右）中的沉淀物比原来PCR buffer（左）中的沉淀物更紧密。紧密的沉淀物比松散的沉淀物更容易干燥，易于重悬。
 
困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
图4. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian 提升了灵敏度和重复再现性。上图为以1 ng和10 ng人肺FFPE来源的总RNA起始，分别采用Pico v1和Pico v2构建文库，NextSeq 500测序数据。Panel A. 以1 ng和10 ng样品起始，分别采用Pico v1和v2构建文库的测序数据。Panel B. 不同样品起始量之间，转录本表达水平的比较分析。
 
Technote：
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困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
困难样本RNA-Seq建库策略
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延伸阅读
病原微生物NGS解决方案来了，您准备好项目了吗？
Takara真香推荐—简便准确好用的液态活检解决方案之游离RNA篇
『石以砥焉，化钝为利！』Takara匠心打磨FFPE样本分析利器
 
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NEBNext 酶学转化法甲基化建库多样本接头引物（双端检索引物） #E7140L 96 reactions-NEB酶试剂 New England Biolabs

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上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品资料 – 用于二代测序的 NEBNext® 试剂 – 适用于Illumina测序平台: 模块和酶

NEBNext 酶学转化法甲基化建库多样本接头引物（双端检索引物）                              收藏

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NEBNext 甲基化建库酶学转化法模块

NEBNext Q5U™ 预混液

NEBNext 酶学转化法甲基化建库多样本接头引物（双端检索引物）

概述

虽然重亚硫酸盐测序是研究 DNA 甲基化的金标准，但这种转化方式会对DNA 造成损伤，导致 DNA 断裂、丢失和 GC 偏嗜。NEBNext 酶学转化法甲基化建库试剂盒 (EM-seq™) 提供了一种酶学方法代替全基因组重亚硫酸盐处理 DNA (WGBS) 的方法，并结合高效流程化的建库步骤，适用于 Illumina 平台测序。高效的 EM-Seq 酶促转化可最大程度地减少对DNA的损伤，结合提供的 NEBNext Ultra II 文库制备流程，最终产生的高质量文库可以从有限的测序数据中更灵敏的检测到 5-mC 和 5-hmC。

优势

更卓越的 5-mC 和 5-hmC 检测灵敏度

更高的比对率

更均一的 GC 覆盖度

能从有限的测序数据检测到更多的 CpG 位点

更均一的二核苷酸分布

更长的文库插入片段

更高效的建库流程

提供转化模块

NEBNext 酶学转化法甲基化建库多样本接头引物（双端检索引物） #E7140L 96 reactions

产品特点

 NEBNext 酶学转化法甲基化建库多样本接头引物（双端检索引物） #E7140L 96 reactions

EM-Seq 能得到更高的文库产量。采用Covaris S2 仪器将 10 ng、50 ng 和 200 ng 不同起始量的人 NA12878 基因组 DNA 打断至 300 bp，同时作为 EM-Seq 和 WGBS 建库的起始样本。对于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 进行建库，随后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold 试剂盒进行重亚硫酸盐转化。上述所有起始量，EM-Seq 都能使用更少的 PCR 循环得到更高的文库产量，表明 EM-Seq 显著减少了 WGBS 方法中的 DNA 损失。误差条表示标准差。

NEBNext 酶学转化法甲基化建库多样本接头引物（双端检索引物） #E7140L 96 reactions

NEBNext 酶学转化法甲基化文库可获得更长的插入片段 。采用Covaris® S2 仪器将 50 ng 人 NA12878 基因组 DNA 打断至 300 bp，同时作为 EM-Seq 和 WGBS 建库的起始样本。对于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 进行建库，随后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ 试剂盒进行重亚硫酸盐转化。两个文库均使用 Illumina MiSeq (2 X 76 bases) 测序，片段大小采用 Picard 2.18.14 测定。图中绘制了每个插入片段出现的频率标准化后的数据，结果如图：EM-Seq 建库后的插入片段比 WGBS 方法得到的插入片段更长，说明：酶学转化法不会对 DNA 造成损伤，而重亚硫酸盐处理的 DNA 有严重损伤。

 

NEBNext 酶学转化法甲基化建库多样本接头引物（双端检索引物） #E7140L 96 reactions

 

 

相较于 WGBS，EM-Seq 在更低的测序深度情况下能检测到更多的 CpG 位点，并能实现更卓越的 GC 均一覆盖度。采用Covaris S2 仪器将 10 ng, 50 ng, 200 ng 不同起始量的人 NA12878 基因组 DNA 打断至 300 bp，同时作为 EM-Seq 和 WGBS 建库的起始样本。对于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 进行建库，随后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ 试剂盒进行重亚硫酸盐转化。两个文库均使用 Illumina NovaSeq® 6000 (2 X 100 bases) 测序，使用 bwa-meth 0.2.2 将 测序数据 与 hg38 进行比对。

A: CpG 位点检测：通过分析 3.24 亿双端数据得到 EM-Seq 和 WGBS 文库的 CpG 位点覆盖度，其中每条链都独立计数，最终得到最多 5600 万个可能的 CpG 位点。结果显示：EM-Seq 在更低测序深度能检测到更多的 CpG 位点。

B: GC 覆盖度：使用 Picard 2.17.2 计算 GC 覆盖度，图中显示不同 GC 含量时 (0-100%)，标准化后覆盖度的分布情况。结果显示：EM-Seq 文库显著提高 GC 覆盖度的均一性，无 AT 过度测序，也无 GC 测序不足，后两项都是 WGBS 文库的典型缺陷。

NEBNext 酶学转化法甲基化建库多样本接头引物（双端检索引物） #E7140L 96 reactions

 

 

相较于 WGBS，EM-Seq 在更低的测序深度情况下能检测到更多的 CpG 位点。采用 Covaris S2 仪器将 10 ng、50 ng 和 200 ng 不同起始量的人 NA12878 基因组 DNA 打断至 300 bp，同时作为 EM-Seq 和 WGBS 建库的起始样本。对于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 进行建库，随后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ 试剂盒进行重亚硫酸盐转化。两个文库均使用 Illumina NovaSeq® 6000（2 X 100 bases）测序，使用 bwa-meth 0.2.2 将测序数据与 hg38 进行比对。通过分析 3.24 亿双端数据得到 EM-Seq 和 WGBS 文库的 CpG 位点覆盖度。

图中显示了 EM-Seq 和 WGBS 两种方法在不同起始量，至少 1X 和 8X 测序深度下检测到的独有和共有的 CpG 位点。EM-Seq 在至少 1X 测序深度下比 WGBS 多检测到 20% 以上的 CpG 位点。而在至少 8X 测序深度下，CpG 位点覆盖度差异增加至 2 倍。

 

EBNext 表观遗传建库多样本引物试剂盒 3（Unique 双端 Index 引物） #E3404S 96 次反应-NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品资料 – 用于二代测序的 NEBNext® 试剂 – 适用于 Illumina 测序平台/接头 & 引物

EBNext 表观遗传建库多样本引物试剂盒 3（Unique 双端 Index 引物）                              收藏

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NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒
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产品特点：

 

• 针对包含 E5hmC-seq 在内的 NEBNext 表观遗传学实验流程进行了优化
• 解决了 Illumina 测序中出现的“条形码跳跃”问题
• 使用独特的双端引物对提高样本识别特异性
 

产品概述：

NEBNext 表观遗传建库多样本引物试剂盒 3（Unique 双端 Index 引物）包含 96 对独特的 i5 和 i7 双端索引引物，这些引物针对包含 E5hmC-seq™ 在内的 NEBNext 表观遗传学实验流程进行了优化，可用于 Illumina® 测序平台。引物为减少标签跳跃而设计，能够在文库扩增过程中结合独特的索引对。
在 PCR 过程中，使用这些独特的双端索引引物对引入索引，这些引物针对 Illumina® 测序平台 NEBNext 表观遗传学实验流程进行了优化，包含 NEBNext E5hmC-seq™。引物为减少标签跳跃而设计，能标记多个样本。提供 96 个预混的 i5 和 i7 8 碱基索引引物对，包装在一个一次性的密封着可穿刺的铝箔封板膜 96 孔板中，便于一次性使用。
NEBNext 表观遗传建库多样本引物试剂盒 3（Unique 双端 Index 引物）（NEB #E3404S）和 24 次反应的 NEBNext 表观遗传建库多样本引物试剂盒 2B（Unique 双端 Index 引物）（NEB #E3392S）引物兼容，组合使用可以标记多达 120 个样本。
使用 NEBNext 表观遗传建库多样本引物时，请参阅 NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒说明书（NEB#E3350）。
 

NEBNext® 5hmC 甲基化建库酶学转化法模块 #E3365L 96 次反应-NEB酶试剂 New England Biolabs

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#E3365L
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 NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒

#E3350L       96 次反应
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NEBNext® 表观遗传建库多样本引物试剂盒 2B（Unique 双端 Index 引物）
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NEBNext 表观遗传建库多样本引物试剂盒 3（Unique 双端 Index 引物）
#E3404S       96 次反应
 

产品特点

• 卓越的 5hmC 检测灵敏度

• 起始量范围广：0.1 – 200 ng
• 转化效率高
• 最大限度地减少对 DNA 的损伤
• 可单独购买包含文库制备试剂的 NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒（NEB #E3350）
 

产品概述：

 NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒（E5hmC-seq™）是一种在单碱基水平上特异性检测 5hmC 位点的新方法。使用酶学转化法能最大限度地减少对 DNA 的损伤，并可区分 5hmC 与 5mC 和胞嘧啶。

NEBNext® 5hmC 甲基化建库酶学转化法模块使用高效的酶学转化法，实现在单碱基水平上特异性检测 5hmC 位点。在 E5hmC-seq 两步酶法转化过程中，T4-BGT 对 5hmC 进行糖基化，使得 5hmC 在下一步 APOBEC 脱氨基反应中被保护了起来。T4-BGT 不保护 5mC 和未甲基化的胞嘧啶，它们被 APOBEC 脱氨基为尿嘧啶。
在针对 Illumina® 测序平台制备 E5hmC-seq 文库时,推荐您使用 NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒（NEB #E3350），而不是使用该转化模块。试剂盒中包含 E5hmC-seq 接头和 NEBNext Ultra™ II 文库制备试剂，而该转化模块中并不含有。
 
 
E5hmC-seq 转化原理
NEBNext® 5hmC 甲基化建库酶学转化法模块 #E3365L 96 次反应
 
为了实现特异性的 5hmC 检测，首先使用 T4-BGT 对 5hmC 进行糖基化。然后，5mC 和未修饰的胞嘧啶在 APOBEC 的作用下，分别脱氨基生成胸腺嘧啶和尿嘧啶，而受保护的 5hmC 则未被转化。
 

困难样本建库-SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian酶试剂盒Takara Clontech

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Mammalian以皮克级总RNA构建Illumina链特性RNA-seq文库
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核糖体RNA在总RNA中占有很高的比重（~90%）。在制备文库前从总RNA中去除掉这些大量的RNA，有利于降低测序成本，提高统计数据的比对比率。但是在以微量样品起始时，如果一开始就从总RNA中去除rRNA，会造成纯化后的起始样品太少而不能制备高品质测序文库，本试剂采用专有的特异针对哺乳动物rRNA和部分线粒体RNA的探针去除核糖体cDNA（来源于核糖体RNA的cDNA片段）。采用本试剂制备的文库与前代试剂制备的文库接头配置不同，即使是使用基于双通道SBS技术的Illumina平台如NextSeq®， MiniSeq™， 和 HiSeq® 3000/4000测序时，不需要添加大量PhiX也可以获得高比例的簇通过过滤百分比(%PF)。每个run可以获得更多的生物学相关测序reads，这又反过来减少了测序成本。采用Pico v2 Kit同样可以获得更多的特异转录本，更低的rRNA、mtRNA比对率和重复率。此外，Pico v2 Kit包含了一种新的PCR buffer，提高了文库纯化效率。
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NEBNext 甲基化建库酶学转化法模块 #E7125L 96 reactions-NEB酶试剂 New England Biolabs

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上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品资料 – 用于二代测序的 NEBNext® 试剂 – 适用于Illumina测序平台: 模块和酶

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NEBNext 甲基化建库酶学转化法模块

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NEBNext 酶学转化法甲基化建库多样本接头引物（双端检索引物）

概述

虽然重亚硫酸盐测序是研究 DNA 甲基化的金标准，但这种转化方式会对DNA 造成损伤，导致 DNA 断裂、丢失和 GC 偏嗜。NEBNext 酶学转化法甲基化建库试剂盒 (EM-seq™) 提供了一种酶学方法代替全基因组重亚硫酸盐处理 DNA (WGBS) 的方法，并结合高效流程化的建库步骤，适用于 Illumina 平台测序。高效的 EM-Seq 酶促转化可最大程度地减少对DNA的损伤，结合提供的 NEBNext Ultra II 文库制备流程，最终产生的高质量文库可以从有限的测序数据中更灵敏的检测到 5-mC 和 5-hmC。

优势

更卓越的 5-mC 和 5-hmC 检测灵敏度

更高的比对率

更均一的 GC 覆盖度

能从有限的测序数据检测到更多的 CpG 位点

更均一的二核苷酸分布

更长的文库插入片段

更高效的建库流程

提供转化模块

NEBNext 甲基化建库酶学转化法模块 #E7125L 96 reactions

产品特点

 NEBNext 甲基化建库酶学转化法模块 #E7125L 96 reactions

EM-Seq 能得到更高的文库产量。采用Covaris S2 仪器将 10 ng、50 ng 和 200 ng 不同起始量的人 NA12878 基因组 DNA 打断至 300 bp，同时作为 EM-Seq 和 WGBS 建库的起始样本。对于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 进行建库，随后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold 试剂盒进行重亚硫酸盐转化。上述所有起始量，EM-Seq 都能使用更少的 PCR 循环得到更高的文库产量，表明 EM-Seq 显著减少了 WGBS 方法中的 DNA 损失。误差条表示标准差。

NEBNext 甲基化建库酶学转化法模块 #E7125L 96 reactions

NEBNext 酶学转化法甲基化文库可获得更长的插入片段 。采用Covaris® S2 仪器将 50 ng 人 NA12878 基因组 DNA 打断至 300 bp，同时作为 EM-Seq 和 WGBS 建库的起始样本。对于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 进行建库，随后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ 试剂盒进行重亚硫酸盐转化。两个文库均使用 Illumina MiSeq (2 X 76 bases) 测序，片段大小采用 Picard 2.18.14 测定。图中绘制了每个插入片段出现的频率标准化后的数据，结果如图：EM-Seq 建库后的插入片段比 WGBS 方法得到的插入片段更长，说明：酶学转化法不会对 DNA 造成损伤，而重亚硫酸盐处理的 DNA 有严重损伤。

 

NEBNext 甲基化建库酶学转化法模块 #E7125L 96 reactions

 

 

相较于 WGBS，EM-Seq 在更低的测序深度情况下能检测到更多的 CpG 位点，并能实现更卓越的 GC 均一覆盖度。采用Covaris S2 仪器将 10 ng, 50 ng, 200 ng 不同起始量的人 NA12878 基因组 DNA 打断至 300 bp，同时作为 EM-Seq 和 WGBS 建库的起始样本。对于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 进行建库，随后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ 试剂盒进行重亚硫酸盐转化。两个文库均使用 Illumina NovaSeq® 6000 (2 X 100 bases) 测序，使用 bwa-meth 0.2.2 将 测序数据 与 hg38 进行比对。

A: CpG 位点检测：通过分析 3.24 亿双端数据得到 EM-Seq 和 WGBS 文库的 CpG 位点覆盖度，其中每条链都独立计数，最终得到最多 5600 万个可能的 CpG 位点。结果显示：EM-Seq 在更低测序深度能检测到更多的 CpG 位点。

B: GC 覆盖度：使用 Picard 2.17.2 计算 GC 覆盖度，图中显示不同 GC 含量时 (0-100%)，标准化后覆盖度的分布情况。结果显示：EM-Seq 文库显著提高 GC 覆盖度的均一性，无 AT 过度测序，也无 GC 测序不足，后两项都是 WGBS 文库的典型缺陷。

NEBNext 甲基化建库酶学转化法模块 #E7125L 96 reactions

 

 

相较于 WGBS，EM-Seq 在更低的测序深度情况下能检测到更多的 CpG 位点。采用 Covaris S2 仪器将 10 ng、50 ng 和 200 ng 不同起始量的人 NA12878 基因组 DNA 打断至 300 bp，同时作为 EM-Seq 和 WGBS 建库的起始样本。对于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 进行建库，随后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ 试剂盒进行重亚硫酸盐转化。两个文库均使用 Illumina NovaSeq® 6000（2 X 100 bases）测序，使用 bwa-meth 0.2.2 将测序数据与 hg38 进行比对。通过分析 3.24 亿双端数据得到 EM-Seq 和 WGBS 文库的 CpG 位点覆盖度。

图中显示了 EM-Seq 和 WGBS 两种方法在不同起始量，至少 1X 和 8X 测序深度下检测到的独有和共有的 CpG 位点。EM-Seq 在至少 1X 测序深度下比 WGBS 多检测到 20% 以上的 CpG 位点。而在至少 8X 测序深度下，CpG 位点覆盖度差异增加至 2 倍。

 

NEBNext® 表观遗传建库多样本引物试剂盒 2B（Unique 双端 Index 引物） #E3392S 24 次反应-NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品资料 – 用于二代测序的 NEBNext® 试剂 – 适用于 Illumina 测序平台/接头 & 引物

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产品特点

• 针对包含 E5hmC-seq 在内的 NEBNext 表观遗传学实验流程进行了优化
• 解决了 Illumina 测序中出现的“条形码跳跃”问题
• 使用独特的双端引物对提高样本识别特异性
 

产品概述：

 EBNext® 表观遗传建库多样本引物试剂盒 2B（Unique 双端 Index 引物）包含 24 对独特的 i5 和 i7 双端索引引物，这些引物针对包含 E5hmC-seq™ 在内的 NEBNext 表观遗传学实验流程进行了优化，可用于 Illumina® 测序平台。引物为减少标签跳跃而设计，能够在文库扩增过程中结合独特的索引对。

在 PCR 过程中，使用这些独特的双端索引引物对引入索引，这些引物针对 Illumina® 测序平台 NEBNext 表观遗传学实验流程进行了优化，包含 NEBNext E5hmC-seq™。引物为减少标签跳跃而设计，能标记多个样本。提供 24 个预混的 i5 和 i7 8 碱基索引引物对，包装在一个一次性的密封着可穿刺的铝箔封板膜 24 孔板中，便于一次性使用。
NEBNext 表观遗传建库多样本引物试剂盒 2B（Unique 双端 Index 引物）（NEB #E3392S）和 96 次反应的 NEBNext 表观遗传建库多样本引物试剂盒 3（Unique 双端 Index 引物）（NEB #E3404S）引物兼容，组合使用可以标记多达 120 个样本。
使用 NEBNext 表观遗传建库多样本引物时，请参阅 NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒说明书NEB#E3350）。
 

NEBNext 酶学转化法甲基化建库试剂盒 #E7120L 96 reactions-NEB酶试剂 New England Biolabs

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虽然重亚硫酸盐测序是研究 DNA 甲基化的金标准，但这种转化方式会对DNA 造成损伤，导致 DNA 断裂、丢失和 GC 偏嗜。NEBNext 酶学转化法甲基化建库试剂盒 (EM-seq™) 提供了一种酶学方法代替全基因组重亚硫酸盐处理 DNA (WGBS) 的方法，并结合高效流程化的建库步骤，适用于 Illumina 平台测序。高效的 EM-Seq 酶促转化可最大程度地减少对DNA的损伤，结合提供的 NEBNext Ultra II 文库制备流程，最终产生的高质量文库可以从有限的测序数据中更灵敏的检测到 5-mC 和 5-hmC。

优势

更卓越的 5-mC 和 5-hmC 检测灵敏度

更高的比对率

更均一的 GC 覆盖度

能从有限的测序数据检测到更多的 CpG 位点

更均一的二核苷酸分布

更长的文库插入片段

更高效的建库流程

提供转化模块

NEBNext 酶学转化法甲基化建库试剂盒 #E7120L 96 reactions

产品特点

 NEBNext 酶学转化法甲基化建库试剂盒 #E7120L 96 reactions

EM-Seq 能得到更高的文库产量。采用Covaris S2 仪器将 10 ng、50 ng 和 200 ng 不同起始量的人 NA12878 基因组 DNA 打断至 300 bp，同时作为 EM-Seq 和 WGBS 建库的起始样本。对于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 进行建库，随后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold 试剂盒进行重亚硫酸盐转化。上述所有起始量，EM-Seq 都能使用更少的 PCR 循环得到更高的文库产量，表明 EM-Seq 显著减少了 WGBS 方法中的 DNA 损失。误差条表示标准差。

NEBNext 酶学转化法甲基化建库试剂盒 #E7120L 96 reactions

NEBNext 酶学转化法甲基化文库可获得更长的插入片段 。采用Covaris® S2 仪器将 50 ng 人 NA12878 基因组 DNA 打断至 300 bp，同时作为 EM-Seq 和 WGBS 建库的起始样本。对于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 进行建库，随后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ 试剂盒进行重亚硫酸盐转化。两个文库均使用 Illumina MiSeq (2 X 76 bases) 测序，片段大小采用 Picard 2.18.14 测定。图中绘制了每个插入片段出现的频率标准化后的数据，结果如图：EM-Seq 建库后的插入片段比 WGBS 方法得到的插入片段更长，说明：酶学转化法不会对 DNA 造成损伤，而重亚硫酸盐处理的 DNA 有严重损伤。

 

NEBNext 酶学转化法甲基化建库试剂盒 #E7120L 96 reactions

 

 

相较于 WGBS，EM-Seq 在更低的测序深度情况下能检测到更多的 CpG 位点，并能实现更卓越的 GC 均一覆盖度。采用Covaris S2 仪器将 10 ng, 50 ng, 200 ng 不同起始量的人 NA12878 基因组 DNA 打断至 300 bp，同时作为 EM-Seq 和 WGBS 建库的起始样本。对于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 进行建库，随后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ 试剂盒进行重亚硫酸盐转化。两个文库均使用 Illumina NovaSeq® 6000 (2 X 100 bases) 测序，使用 bwa-meth 0.2.2 将 测序数据 与 hg38 进行比对。

A: CpG 位点检测：通过分析 3.24 亿双端数据得到 EM-Seq 和 WGBS 文库的 CpG 位点覆盖度，其中每条链都独立计数，最终得到最多 5600 万个可能的 CpG 位点。结果显示：EM-Seq 在更低测序深度能检测到更多的 CpG 位点。

B: GC 覆盖度：使用 Picard 2.17.2 计算 GC 覆盖度，图中显示不同 GC 含量时 (0-100%)，标准化后覆盖度的分布情况。结果显示：EM-Seq 文库显著提高 GC 覆盖度的均一性，无 AT 过度测序，也无 GC 测序不足，后两项都是 WGBS 文库的典型缺陷。

NEBNext 酶学转化法甲基化建库试剂盒 #E7120L 96 reactions

 

 

相较于 WGBS，EM-Seq 在更低的测序深度情况下能检测到更多的 CpG 位点。采用 Covaris S2 仪器将 10 ng、50 ng 和 200 ng 不同起始量的人 NA12878 基因组 DNA 打断至 300 bp，同时作为 EM-Seq 和 WGBS 建库的起始样本。对于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 进行建库，随后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ 试剂盒进行重亚硫酸盐转化。两个文库均使用 Illumina NovaSeq® 6000（2 X 100 bases）测序，使用 bwa-meth 0.2.2 将测序数据与 hg38 进行比对。通过分析 3.24 亿双端数据得到 EM-Seq 和 WGBS 文库的 CpG 位点覆盖度。

图中显示了 EM-Seq 和 WGBS 两种方法在不同起始量，至少 1X 和 8X 测序深度下检测到的独有和共有的 CpG 位点。EM-Seq 在至少 1X 测序深度下比 WGBS 多检测到 20% 以上的 CpG 位点。而在至少 8X 测序深度下，CpG 位点覆盖度差异增加至 2 倍。

 

NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒 #E3350L 96 次反应-NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品资料 – 用于二代测序的 NEBNext® 试剂 – 适用于 Illumina 测序平台/Ultra II DNA & RNA

NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒                              收藏

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#E3350L
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NEBNext® 5hmC 甲基化建库酶学转化法模块
#E3365L       96 次反应
#E3365S       24 次反应
 
NEBNext® 表观遗传建库多样本引物试剂盒 2B（Unique 双端 Index 引物）
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NEBNext 表观遗传建库多样本引物试剂盒 3（Unique 双端 Index 引物）
#E3404S       96 次反应
 

产品特点：

• 卓越的 5hmC 检测灵敏度

• 起始量范围广：0.1 – 200 ng
• 更均一的 GC 覆盖度
• 更高效的建库流程
• E5hmC-seq 和 EM-seq 数据结果可联合分析
• 可单独购买转化模块（NEB #E3365）
 

概述：

NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒（E5hmC-seq™）是一种在单碱基水平上特异性检测 5hmC 位点的新方法。
通常，使用基于 NEBNext EM-seq 酶学转化或重亚硫酸盐转化生成的 Illumina 文库，可以检测修饰的 5-甲基胞嘧啶（5mC）和 5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）。然而，这些方法并不能区分 5mC 和 5hmC。
与 EM-seq 相同，NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒（E5hmC-seq™）使用酶学转化法特异性检测 5hmC 位点，不会像重亚硫酸盐转化法对 DNA 造成损伤，即便 DNA 起始量低至 0.1 ng，也能灵敏地检测 5hmC 位点。
在两步酶法转化过程中，T4-BGT 对 5hmC 进行糖基化，使得 5hmC 在下一步 APOBEC 脱氨基反应中被保护了起来。T4-BGT 不保护 5mC 和未甲基化的胞嘧啶，它们被 APOBEC 脱氨基为尿嘧啶。随后使用 NEBNext® Q5U® 预混液（Q5® 高保真 DNA 聚合酶的改良版）进行扩增，并在 Illumina 平台上进行测序。
用于 EM-seq 和重亚硫酸盐测序的生物信息学分析工具也可用于 E5hmC-seq。可以从 EM-seq 数据中减去 E5hmC-seq 数据，从而确定单个 5mC 和 5hmC 的精确位置。
NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒包含 NEBNext Ultra™ II 文库制备试剂和 E5hmC-seq 接头。请注意试剂盒不包含引物，请单独购买（NEBNext 表观遗传建库多样本引物试剂盒, NEB #E3392, NEB #E3404）
 
E5hmC-seq 转化原理
NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒 #E3350L 96 次反应
 

产品描述：

 NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒 #E3350L 96 次反应

使用不同起始量进行建库，E5hmC 均能获得高产量的文库。

使用 Covaris ME220 仪器将 0.1 ng 至 200 ng 人脑基因组 DNA 打断至 350 bp，并用作 E5hmC-seq 的起始样本，所使用的 PCR 循环数如图所示。使用 Agilent® TapeStation，，High Sensitivity D1000 试剂测定文库产量。显示的数值是四次技术性重复的平均值，误差线表示标准差。结果表明：不同起始量的样本均能获得高产量的 E5hmC-seq 文库。
 NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒 #E3350L 96 次反应
E5hmC-seq 文库 5hmC 检出率高
使用 0.1 ng 至 200 ng 人脑基因组 DNA 制备 E5hmC-seq 文库时，插入所有胞嘧啶完全羟甲基化的 T4 DNA 作为标准品。使用 Covaris ME220 仪器将 DNA 打断至 350 bp，并用作 E5hmC-seq 的起始样本。构建的文库在 Illumina NovaSeq 6000（2 x 150 bases）上进行测序。使用 bwa-meth 将每个文库的 19 亿数据（200 ng、10 ng 和 1 ng）或 7.15 亿 数据（0.5 ng 和 0.1 ng）与人类 T2T、lambda 和 T4 参考基因组的复合基因组进行比对，并使用 MmethylDackel 从中提取甲基化信息。显示的数值是两次技术性重复的平均值，误差线表示标准差。结果表明：T4 DNA 标准品 CpG、CHG 和 CHH 中的 5hmC 检出率 ≥ 98.9%。
 NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒 #E3350L 96 次反应
使用不同起始量人脑 gDNA 进行建库，E5hmC 表现出一致的总 5hmC 检测结果。
使用 Covaris ME220 仪器将 0.1 ng 至 200 ng 人脑基因组 DNA 打断至 350 bp，并用作 E5hmC-seq 的起始样本。构建的文库在 Illumina NovaSeq 6000（2 x 150 bases）上进行测序。使用 bwa-meth 将每个文库的 19 亿数据（200 ng、10 ng 和 1 ng）或 7.15 亿 数据（0.5 ng 和 0.1 ng）与人类 T2T、lambda 和 T4 参考基因组的复合基因组进行比对，并使用 MmethylDackel 从中提取甲基化信息。显示的数值是两次技术性重复的平均值，误差线表示标准差。结果表明：不同起始量的样本在 CpG、CHG 和 CHH 中的 5hmC 占比相似。
NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒 #E3350L 96 次反应
E5hmC-seq 文库 GC 覆盖度均一。
使用 Covaris ME220 仪器将 0.1 ng 至 200 ng 人脑基因组 DNA 打断至 350 bp，并用作 E5hmC-seq 的起始样本。构建的文库在 Illumina NovaSeq 6000（2 x 150 bases）上进行测序。使用 bwa-meth 将每个文库的 19 亿数据（200 ng、10 ng 和 1 ng）或 7.15 亿 数据（0.5 ng 和 0.1 ng）与人类 T2T、lambda 和 T4 参考基因组的复合基因组进行比对。使用 Picard 计算 GC 覆盖度，图中显示不同 GC 含量时（0-100%），标准化后覆盖度的分布情况。将人类 T2T 基因组的 GC 含量分布绘制为直方图。结果表明：不同起始量的样本所制备的 E5hmC-seq 文库皆能获得均一的 GC 覆盖度。
 

 NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒 #E3350L 96 次反应
使用不同起始量进行建库，E5hmC-seq 均能获得高 GC 覆盖度。
使用 Covaris ME220 仪器将 0.1 ng 至 200 ng 人脑基因组 DNA 打断至 350 bp，并用作 E5hmC-seq 的起始样本。构建的文库在 Illumina NovaSeq 6000（2 x 150 bases）上进行测序。使用 bwa-meth 将每个文库的 19 亿数据（200 ng、10 ng 和 1 ng）或 7.15 亿 数据（0.5 ng 和 0.1 ng）与人类 T2T、lambda 和 T4 参考基因组的复合基因组进行比对，并使用 MmethylDackel 从中提取甲基化信息，以 methylkit 形式提供报告。使用 CpG 结果，针对所有起始量的 E5hmC-seq 文库生成 CpG 图谱。正义链和反义链上的 CpG 独立计算，在 T2T 基因组中分析出多达 6780 万个可能的 CpG 位点。使用 0.5 ng 至 200 ng 的起始样本时，E5hmC-seq 始终可以覆盖超过 5600 万个 CpG 位点；即使使用 0.1 ng 起始样本时，也可覆盖约 4800 万个位点。
NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒 #E3350L 96 次反应
E5hmC-seq 文库在更高测序深度下表现出高相关性。
采用 methyKit 绘制 1 ng、10 ng 和 200 ng 起始量下 E5hmC-seq 文库之间的相关性，19 亿数据测序深度，150-base reads，最小覆盖度为 1X（所有文库均使用 5,650 万个 CpG 位点）。200 ng 和 10 ng 起始量文库的相关性 ≥ 0.81。将 200 ng、10 ng 和 1 ng 的 E5hmC-seq 文库逐步向下采样至约 15 亿、11 亿、7 亿和 3 亿的总 reads，并进行相关性分析。我们观察到，与 11 亿、15 亿和 19 亿 reads 相关性相比，3 亿和 7 亿 reads 的相关性较低。结果表明：由于样本中 5hmC 信号的丰度较低，因此需要对 E5hmC-seq 文库进行深度测序。