MTT实验原理是什么？

MTT是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT实验原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
MTT通常用于.细胞增殖及细胞活性测定以及药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
注意事项：
1、在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
2、配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感
3、MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内(个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
4、MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.
通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

MTT实验步骤有哪些，有什么注意事项

MTT通常用于药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定以及.细胞增殖及细胞活性测定。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。但是由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。在MTT实验步骤中要注意的是MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的薄膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。
MTT实验步骤——贴壁细胞
1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况
3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5、终止培养，小心吸去孔内培养液。
6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速震荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）
MTT实验步骤——悬浮细胞
1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 l?g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100?(储存液100 1640）。
2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速震荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
在MTT实验步骤中需要注意的是MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。配制MTT时用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。

MTT法检测细胞活性步骤及原理

要知道MTT法检测细胞活性步骤首先要知道MTT是什么？MTTMTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。
MTT法检测细胞活性原理
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
MTT法检测细胞活性步骤
A.Hela细胞复苏
1.从液氮容器中取出从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上DEME培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度至1×104个/mL，部分接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养，此后定期更换培养液，维持细胞正常活性。
B.MTT检测复苏细胞的细胞活性
Hela细胞计数用血细胞计数板的四个角上的方块。
1.接种培养瓶同时，将其余部分接种于96孔细胞培养板，7组，每组5孔，每孔100μL,37℃培养箱静置培养；
2.培养24h后，向每孔内加入用磷酸缓冲液配制的0.5%MTT（5mg/mL）20uL，37℃培养箱内培育；
3.4h后终止培养，将孔内培养液小心吸出。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。同时每行第一孔设置为调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）。用酶标仪OD570nm处测量各孔吸光值；
C.细胞生长曲线制作
接B.2，B.3步骤，连续测量7天，根据测量结果绘制细胞生长曲线。
[横坐标生长时间，纵坐标吸光度值。]
D.探究某药物对于细胞活性的影响
1.将之前培养于培养瓶中的细胞用0.5%胰蛋白酶洗脱，加入DEME培养液制成细胞密度为1×106个/mL的细胞悬液；
2.设置空白对照组及5个不同药物梯度的实验组，分别加载96孔培养板内（5个梯度剂量按药物种类待定），每个剂量分别设置5个平行孔，每孔加入细胞悬液100μL（在加药的前一天下午完成铺板）；
3.次日上午按预先设置的药物梯度加药，后置37℃培养箱培养24h；
4.每孔加入20μLMTT溶液，继续培养4h（若药物能与MTT反应，可以先离心后弃去上清液，用PBS冲洗2-3遍后再加入MTT溶液）
5终止培养，小心吸去孔内培养液；
6.每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，用酶标仪OD490nm处测量各孔的吸光度；
7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
E.Hela细胞冻存?
1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2.取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接细胞移至15ml离心管中；
3.离心1000rpm，5min；
4.去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
5.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5?ml；
6.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/?min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10
℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h?，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

MTT法检测细胞活性其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氧酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。MTT法检测细胞活性该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。